МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Вакцина чумная живая ФС.3.3.1.0022.15

В замен ГФ Х, ст. 713

ФС 42-3877-99

Настоящая фармакопейная статья распространяется на вакцину чумную живую, лиофилизат для приготовления суспензии для инъекций, накожного скарификационного нанесения и ингаляций, представляющую собой живую культуру вакцинного штамма чумного микроба Yersinia pestis EV линии НИИЭГ, высушенную методом лиофилизации в стабилизирующей среде.

Вакцина предназначена для профилактики чумы и вызывает развитие специфического иммунитета продолжительностью до 1 года.

ПРОИЗВОДСТВО

Вакцинный штамм Y . pestis EV линии НИИЭГ должен обладать типичными морфологическими, культуральными и биохимическими свойствами; содержать плазмиды pFra, пестициногенности (pPst) и кальций-зависимости (pCad) с молекулярными массами » 60 , » 6 и » 47 MDa соответственно; не должен вызывать гибель морских свинок и потерю их массы при введении в дозе 15 10 9 микробных клеток (м.к.). Иммуногенность штамма по величине ЕD 50 при подкожном введении не должна превышать для морских свинок 10 3 м.к., для белых мышей – 10 4 м.к.

Перед приготовлением очередной серии вакцинного штамма Y . pestis EV линии НИИЭГ проводят его пассаж через организм морской свинки с последующим отбором типичных колоний, выросших на чашках Петри с агаром Хоттингера из посевов селезенки и регионарных лимфатических узлов.

Технология изготовления вакцины предусматривает получение посевных культур Y . pestis EV линии НИИЭГ I, II и III генераций; процесс накопления биомассы, выращенной для приготовления вакцинной взвеси с необходимой концентрацией; последующий розлив, замораживание, сублимационное высушивание, герметизацию и упаковку препарата. На стадиях приготовления посевных культур определяют рН, концентрацию микробных клеток и отсутствие посторонней микрофлоры.

В зависимости от технологии приготовления вакцины в процессе производства используются вспомогательные вещества, разрешенные для использования при производстве иммунобиологических лекарственных препаратов: сахароза, желатин, тиомочевина, декстрин, аскорбиновая кислота.

ИСПЫТАНИЯ

Описание

Пористая масса серовато-белого цвета.

Подлинность

Вакцина должна содержать чистую культуру вакцинного штамма Y . pestis EV линии НИИЭГ. Определение проводят иммунофлуоресцентным методом с помощью иммуноглобулинов чумных диагностических флуоресцирующих, в соответствии с инструкцией по применению. В мазках из препарата микробные клетки должны светиться по периферии ярко-зеленым цветом.

Время растворения

Должна полностью растворяться в течение 3 мин при добавлении 1,8 мл 0,9 % раствора натрия хлорида.

Восстановленный препарат – гомогенная суспензия серовато-белого цвета без посторонних примесей и хлопьев. Определение проводят визуально.

Время седиментационной устойчивости

Суспензия не должна расслаиваться в течение 5 мин. Определение проводят в соответствии с .

Размер частиц

Суспензия должна свободно проходить в шприц через иглу № 0840. Определение проводят в соответствии с .

рН

От 6,8 до 7,8. Определение проводят потенциометрическим методом в соответствии с . Для испытания используют 5 образцов.

Потеря в массе при высушивании

Не более 4,0 %. Определение проводят гравиметрическим методом в соответствии с . Для испытания используют 5 образцов.

Средняя масса и отклонение от средней массы

Коэффициент вариации массы вакцины в ампулах (флаконах) должен быть не более 5 %. Определение проводят в соответствии с .

Отсутствие посторонних микроорганизмов и грибов

Вакцина не должна содержать посторонних микроорганизмов и грибов. Определение проводят в соответствии с методом прямого посева на тиогликолевую среду.

В ампулу (флакон) с вакциной вносят 2 мл 0,9 % раствора натрия хлорида. По 1 мл каждого образца полученной взвеси засевают в пробирки, содержащие по 20 мл тиогликолевой среды. Одну пробирку из каждого образца инкубируют при температуре от 30 до 35 о С для выявления аэробных и анаэробных микроорганизмов, другую — при температуре от 20 до 25 о С для выявления грибов. Через 5 – 7 сут из каждой пробирки производят пересев по 0,5 мл в 2 пробирки, содержащие по 10 мл тиогликолевой среды, и инкубируют при указанных выше температурах. Через 14 сут выращивания со дня первичного посева из всех пробирок делают мазки, окрашивают их по Граму, просматривают под микроскопом при увеличении К7×40.

В случае обнаружения хотя бы в одном из 10 просмотренных полей зрения кокков или грамположительных палочек препарат считается контаминированным посторонней микрофлорой.

При выявлении в мазках грамотрицательных палочек, отличающихся по морфологии от чумного микроба, готовят мазки, которые окрашивают иммуноглобулинами чумными диагностическими флуоресцирующими в соответствии с инструкцией по применению и просматривают в каждом мазке не менее 10 полей с помощью люминесцентного микроскопа. Если не все бактерии, обнаруживаемые в вакцине, дают специфическое ярко-зеленое свечение по периферии клеток, препарат считают не выдержавшим испытание.

Специфическая безопасность

Вакцина должна быть безопасной. Испытание проводят на морской свинке массой (275 ± 25) г.

Содержимое ампулы (флакона) растворяют в 1,8 мл 0,9 % раствора натрия хлорида, определяют концентрацию по методике, описанной в разделе «Специфическая активность (концентрация микробных клеток)», разводят 0,9 % раствором натрия хлорида до концентрации 15 · 10 9 м.к./мл и вводят подкожно в объеме 1 мл одной морской свинке во внутреннюю поверхность бедра.

На 6 сут морскую свинку взвешивают, подвергают эвтаназии, отмечают патологоанатомические изменения, обнаруживаемые при вскрытии. Печень, селезенку, легкие, регионарные лимфатические узлы, кровь и ткани из места введения высевают методом отпечатков на чашку Петри с агаром Хоттингера, рН (7,2 ± 0,1), с добавлением натрия сернистокислого 0,25 г на 1 л среды и на чашку Петри с агаром Хоттингера, рН (7,2 ± 0,1), с добавлением генцианвиолета 0,05 г на 1 л среды. Посевы инкубируют при температуре (27 ± 1) о С в течение 3 сут.

Вакцина не должна вызывать у морской свинки потерю массы к 6 сут после введения больше чем на 20 %, не должна вызывать видимых патологоанатомических изменений в легких — кровоизлияний, очагов воспаления, гранулем, абсцессов; в посевах крови и легких не должно быть роста чумного микроба. В месте введения допускается развитие кровоизлияния и инфильтрата подкожной клетчатки, переходящих в некроз. Во внутренних органах (селезенка и печень) допустимо развитие ограниченной узелковой реакции.

Специфическая активность

1. Концентрация микробных клеток . В препарате должно содержаться от 5 · 10 10 до 10 11 м.к. в 1 мл. Определение проводят в 3 образцах для каждой серии. Колебания результатов определений в отдельных образцах не должны превышать 5 % от средней арифметической величины.

Содержимое ампулы (флакона) растворяют в 1,8 мл 0,9 % раствора натрия хлорида. В стандартную пробирку вносят 0,1 мл разведенного препарата и добавляют 0,9 % раствор натрия хлорида до достижения концентрации стандартного образца (СО) мутности (10 МЕ). Объем 0,9 % раствора натрия хлорида, использованный при разведении, учитывают при расчете концентрации микробных клеток (ОК) по формуле:

ОК = (0,1 + n ) ·10,

0,1 – объем растворенной вакцины, мл;

n – объем 0,9 % раствора натрия хлорида, использованный при разведении пробы, мл;

10 – постоянная величина.

1. Количество живых микробных клеток . Количество живых микробных клеток должно составлять не менее 25 % от общего количества микробных клеток. Колебания результатов определения в отдельных образцах не должны превышать 20 % от средней арифметической величины.

При определении количества живых микробных клеток в вакцине используют концевые химически чистые пипетки и пробирки с 0,9 % раствором натрия хлорида, которые должны быть охлаждены до температуры от 2 до 8 о С.

Для определения количества живых микробных клеток из приготовленных ранее образцов взвесей вакцины делают последовательные десятикратные разведения от 10 -1 до 10 -8 , используя для каждого разведения отдельную пипетку вместимостью 1 мл. Из пробирок с разведениями 10 -7 и 10 -8 высевают пипеткой по 0,1 мл взвеси на 2 чашки Петри с питательной средой для выделения и культивирования чумного микроба или с агаром Хоттингера со стимулятором роста (кровь гемолизированная до 1 % концентрации) или натрий сернистокислый (0,25 г на 1 л среды).

Через 72 – 96 ч инкубации при температуре (27 ± 1) о С подсчитывают количество колоний для каждого образца, принимая за 100 % количество микробных клеток, высеянных, исходя из показателя общей концентрации микробных клеток для данного образца, определенной с помощью СО мутности (10 МЕ). За количество жизнеспособных микробных клеток для каждой серии принимают среднее арифметическое определений для 3 ампул (флаконов).

Исходя из количества жизнеспособных микробных клеток в ампуле (флаконе) с вакциной рассчитывают количество доз и объем растворителя каждой серии для приготовления суспензии для инъекций, накожного скарификационного нанесения и ингаляций.

Для достоверности полученных результатов параллельно используют стандартный образец вакцины чумной живой.

1. Иммуногенность . ЕD 50 вакцины для морских свинок не должна превышать 10 4 , для белых мышей — 4 ·10 4 живых микробных клеток. Испытание проводят на морских свинках массой (275 ± 25) г и на белых нелинейных мышах массой (19 ± 1) г. Вакцину разводят с таким расчетом, чтобы в 1 мл содержалось 10 9 живых м.к. Исходя из заранее определенного количества живых м.к., вакцину разводят для иммунизации морских свинок до концентраций 2 · 10 5 ; 4 · 10 4 ; 8 · 10 3 и 16 · 10 2 м.к./мл; белых мышей — до концентраций 5 · 10 5 ; 1 · 10 5 ; 2 · 10 4 и 4 ·10 3 м.к./мл. Каждую дозу препарата вводят однократно 6 животным. Морских свинок иммунизируют подкожно во внутреннюю поверхность левого бедра в объеме 0,5 мл; белых мышей – в объеме 0,2 мл дозами 8 · 10 2 , 4 · 10 3 , 2 · 10 4 и 1 ·10 5 живых м.к.

Для определения фактического содержания живых микробных клеток в иммунизирующих дозах взвесь, содержащую 8 ·10 3 м.к./мл, используемую при иммунизации морских свинок, или дозу 4 · 10 3 м.к./мл для иммунизации белых мышей, разводят до концентрации 10 3 м.к./мл. По 0,1 мл взвеси с концентрацией 10 3 м.к./мл (100 м.к.) высевают на 3 чашки Петри с одной из вышеперечисленных питательных сред и инкубируют при температуре (27 ± 1) о С в течение 48 ч. Количество выросших колоний на чашках учитывают при вычислении ЕD 50 испытуемой серии.

Подкожное заражение морских свинок проводят во внутреннюю поверхность правого бедра на 21 сут, мышей – в ту же область на 7 или 21 сут после иммунизации. Заражающая доза для иммунизированных вакциной животных составляет 200 Dcl (Dosis certa letalis = LD 100) вирулентного штамма чумного микроба, 1 Dcl которого не должна превышать 100 микробных клеток.

Подготовка заражающего штамма Y . pestis 231 должна быть указана в нормативной документации.

Для заражения неиммунизированных (контрольных) животных используют взвесь с концентрацией 50 м.к./мл в объеме 0,5 мл для морских свинок и 125 м.к./мл в объеме 0,2 мл для белых мышей, что соответствует 1 Dcl.

Для определения фактического содержания микробных клеток заражающего штамма по 0,1 мл взвеси культуры Y . pestis 231, содержащей 10 3 м.к./мл, высевают на 3 чашки Петри с агаром Хоттингера и равномерно распределяют по всей поверхности среды методом «обкатки» чашек. Посевы инкубируют при температуре (27 ± 1) ºС в течение 48 ч, после чего подсчитывают количество выросших колоний.

Наблюдение за зараженными животными ведут в течение 20 сут. Все контрольные животные должны погибнуть от чумы в течение 10 сут. Погибших животных вскрывают, берут органы и ткани (у морских свинок берут пробы из места введения, регионарных паховых лимфатических узлов, печени, селезенки, легких, верхушки сердца; у белых мышей – из селезенки), высевая их методом отпечатков на чашки Петри с агаром Хоттингера с добавлением генцианвиолета и с агаром Хоттингера — с натрием сернистокислым. Чашки Петри инкубируют при температуре (27 ± 1) ºС. Учет результатов проводят через 24 — 48 ч.

Павшими от чумы считают только тех животных, из органов которых при высеве выделяется культура Y . pestis .

ЕD 50 вычисляют по формуле:

lg ED 50 = lg D N – S · (∑L i – 0,5),

lg D N – логарифм максимальной иммунизирующей (фактической) дозы;

S – логарифм кратности разведений;

L i — отношение количества животных, выживших при иммунизации данной дозой, к общему количеству животных, которым эта доза была введена;

∑L i — сумма значений L i , найденных для всех испытанных доз.

Если все контрольные животные выжили, или значение ЕD 50 будет более допустимого, контроль повторяют на таком же количестве животных. Если при повторном испытании значение ЕD 50 будет выше допустимого, препарат считают не выдержавшим испытание.

Термостабильность

Не менее 4 сут. Показатель термостабильности (срок, в течение которого в препарате сохраняется 50 % живых микробных клеток по отношению к первоначальному количеству) определяют в 3 образцах после хранения вакцины при температуре (37 ± 1) о С в течение 14 сут.

Методика определения количества живых микробных клеток изложена в разделе «Специфическая активность». Показатель термостабильности (t ) в сут рассчитывают по формуле:

lg A 0 – логарифм первоначального количества живых м.к./мл;

lg A n – логарифм количества живых м.к./мл через 14 сут хранения вакцины при температуре (37 ± 1) °C;

0,3 – постоянная величина;

14 – срок хранения вакцины при температуре (37 ± 1) °C, сут.

Вакцина чумная живая

Инструкция по применению

Вакцина чумная живая лиофилизат для приготовления суспензии для инъекций, накожного скарификационного нанесения и ингаляций, представляет собой лиофилизированную живую культуру вакцинного штамма чумного микроба Yersinia pestis EV линии НИИЭГ, стабилизаторы: сахароза, желатин, тиомочевина.

Пористая масса серовато-белого цвета.

Иммунологические свойства

Вакцина вызывает развитие иммунитета к чуме длительностью до одного года.

Назначение

Профилактика чумы. Прививкам подлежат дети с 2-х лет и взрослые, проживающие в энзоотичных по чуме территориях, а также лица, работающие с живыми культурами возбудителя чумы.

Способ применения и дозировка.

Вакцинацию проводят однократно подкожным, накожным, внутрикожным или ингаляторным способами. Ревакцинацию осуществляют накожным способом через один год, при неблагоприятной эпидемической обстановке – через 6 мес.

Вакцинация накожным, подкожным и внутрикожным способами.

Перед вскрытием каждую ампулу просматривают. Не подлежит применению препарат, целостность упаковки которого повреждена, с измененными физическими свойствами (посторонние примеси, не растворяющие хлопья), с истекшим сроком годности, при нарушении режима хранения.

Вскрытие ампул и процедуру введения препарата осуществляют при строгом соблюдении правил асептики и антисептики. Разведенная вакцина, сохраняемая с соблюдением правил асептики, может быть использована в течение ч. Перенос вскрытой ампулы из одного помещения в другое не допускается. Неиспользованную вакцину уничтожают кипячением в течение 30 мин.

Непосредственно перед иммунизацией вакцину разводят 1,8 мл 0,9% раствора натрия хлорида для инъекций. Препарат должен полностью раствориться в течение 3 мин. Ампулы с вакциной встряхивают. Растворенная вакцина – гомогенная взвесь без посторонних примесей и хлопьев. Полученную взвесь отбирают с помощью стерильного шприца из ампулы и переносят в стерильный флакон, содержащий 0,9% раствор натрия хлорида для инъекций в объеме, соответствующем таковому, указанному на этикетке коробки для соответствующего способа введения. При этом учитывают объем 0,9% раствора натрия хлорида, использованного для приготовления исходного разведения.

В зависимости от возраста прививаемых и способа введения используют следующие дозы вакцины.

Дозы для вакцинации. Накожный способ.

Вакцинацию проводят на наружной поверхности средней трети плеча следующим образом: взрослым оспопрививательным пером слегка соскабливают (до покраснения) поверхностный слой эпидермиса на 3-х участках кожи, предварительно обработанной 70° этиловым спиртом. Расстояние между участками составляет от 3-х до 4-х см, площадь участка от 1 до 1,5 см 2 . При вакцинации детей эпидермис соскабливают на 1 или 2 участках кожи.

На каждый участок скарифицированной кожи пипеткой наносят по 1 капли вакцины, после чего индивидуальным оспопрививательным пером через каждую каплю вакцины крестообразно наносят 4 горизонтальные и 4 вертикальные линейные насечки длиной 1 см. Затем оспопрививательным пером в течение нескольких секунд тщательно втирают капли вакцины в скарифицированную кожу и дают подсохнуть в течение 5 мин. Насечки следует делать неглубокие, чтобы они не кровоточили (кровь может выступать только в виде мелких росинок). Для каждого прививаемого используют отдельное одноразовое оспопрививательное перо. Запрещается взамен перьев пользоваться иглами, скальпелями и т.п.

Дозы для вакцинации. Подкожный способ.

Категорически запрещается использовать вакцину, разведенную для накожного применения! Кожу в месте инъекции предварительно обрабатывают 70° этиловым спиртом. Вакцину вводят шприцем ниже угла лопатки или безыгольным инъектором БИ-ЗМ с противоинфекционным протектором ППИ-2 в верхнюю треть плеча позади дельтовидной мышцы.

Дозы для вакцинации. Внутрикожный способ.

Количество доз и объем растворителя для подростков с 14 лет и взрослых до 60-ти лет указаны на этикетке коробки. Для вакцинации детей в возрасте 10-13 лет объем растворителя при втором разведении удваивают, для вакцинации детей в возрасте от 2 до 9 лет и взрослых старше 60 лет объем растворителя утраивают. Вакцину взрослым и детям вводят в объеме 0,1 мл внутрикожно в область наружной поверхности плеча левой руки после обработки кожи 70° этиловым спиртом с помощью безыгольного инъектора БИ-ЗМ с протектором противоинфекционным ППИ-2 или шприцем объемом 1 мл с тонкой иглой с коротким срезом.

Дозы для вакцинации. Вакцинация ингаляционным способом.

Вакцинацию проводят в специальных помещениях стационарного или временного типа объемом от 50 до 150 м 2 , высотой от 2,5 до 4,5 м (соотношение длины и ширины не более чем 2:1). Указанные помещения должны быть приспособлены для быстрого проветривания, а стационарные ингаляционные должны быть оборудованы вытяжной вентиляцией.

Вакцину разводят 2 мл стерильного 10% раствора лактозы. Ампулу встряхивают до получения гомогенной взвеси. При обнаружении посторонних примесей, неравномерной взвеси использовать препарат запрещается.

Полученную взвесь переносят в стерильный флакон с необходимым для дальнейшего разведения объемом 10% раствора лактозы (согласно указанию на коробке). При этом учитывают объем 10% раствора лактозы, использованный для приготовления исходного разведения. Температура 10% раствора раствора лактозы должна соответствовать температуре, при которой хранился сухой препарат перед разведением.

Полученную микробную суспензию в количестве, определяемом объемом помещения (0,1 мл на 1 м3 помещения), заливают в резервуар распылителя. Распыление производится с помощью пневматического распылителя эжекционного типа. Распылитель устанавливается вертикально, соплом вверх, в центре помещения на высоте 80-120 см от пола. Распыление производят сжатым воздухом под давлением 1,2 атм до полного израсходования суспензии. Продолжительность сеанса иммунизации 5 мин. Одна человеко-доза для ингаляционного применения составляет (5±3)x10 6 живых микробных клеток.

Число людей, иммунизированных за один сеанс, определяется из расчета от 1,4 до 2 м3 помещения на одного человека.

После каждого сеанса иммунизации ингаляционную вентилируют не менее 5 мин. При проведении иммунизации в палате после каждого сеанса откидывают пологи не менее, чем на 5 мин. Персонал, проводящий вакцинацию, в случае необходимости входа в ингаляционную в течение сеанса и первых 5 мин после его окончания, должен быть одет в специальную одежду (нательное белье, носки, хлопчатобумажный комбинезон, противогаз, тапочки).

Проведенные разными способами прививки регистрируют в установленных учетных формах с указанием наименования препарата, изготовителя, даты прививки, дозы, способы введения, номера серии, срока годности, реакции на прививку.

Реакция на введение.

После накожной вакцинации через 24-48 ч на месте введения вакцины могут возникнуть гипермия и инфильтрат с последующим образованием по ходу насечек корочек желтоватого цвета.

Побочные действия.

Прививки вакциной чумной живой могут сопровождаться как общей, так и местной реакциями, интенсивность которых зависит от метода вакцинации.

Накожная прививка может сопровождаться мелкой везикулярной сыпью по ходу насечек, иногда на месте прививки появляется инфильтрат в толще кожи. Реже наблюдаются регионарные лимфадениты. Указанные симптомы начинают появляться через 8-10 ч после прививки, достигают полного развития через 23-30 ч. Общая реакция возникает на первые сутки и выражается повышением температуры до 37,5 °С.

После подкожных и внутрикожных прививок могут наблюдаться местные реакции в виде гипермии, болезненности, инфильтрата диаметром до 50 мм, реже – увеличение регионарных лимфатических узлов. Местные реакции возникают через 6-10 ч, достигают полного развития через 24-48 ч и исчезают через 4-5 сут. Общая реакция выражается в недомогании, головной боли, повышении температуры до 37,5 °С, у одного процента вакцинированных до (38,0-39,0) °С продолжительностью до 3 сут. Иногда наблюдаются тошнота и рвота.

После ингаляционной иммунизации у небольшого числа вакцинированных возможно возникновение недомогания, головные боли, болей в мышцах, повышения температуры до 38,5 °С и очень редко до 40 °С. Продолжительность реакции 1-3 сут. По времени возникновения наблюдаются два типа реакции: ранние, развивающиеся в первые двое суток и характерные для повторно прививаемых; поздние, проявляющиеся на 5-7 сут, и чаще встречающиеся у первично привитых.

Перед массовым применением каждая серия вакцины должна быть испытана на группе людей в 50-100 человек, равнозначной по возрасту и состоянию здоровья основному контингенту прививаемых. Вакцина может быть использована для массовой вакцинации, если количество средних (повышение температуры тела до 37,6-38,5 °С) и сильных (повышение температуры тела выше 38,5 °С) реакций на ее введение не превышает соответственно 29% и 5% при подкожном методе введения, 1% средних реакций при накожном введении и 6% средних или 4% сильных реакций для ингаляционного метода введения.

Противопоказания.

Острые инфекционные и неинфекционные заболевания, хронические заболевания в стадии обострения – прививки проводят не ранее, чем через 1 мес после выздоровления (ремиссии).

Первичные и вторичные иммунодефициты. При лечении стероидными препаратами, антиметаболитами, химио- и рентгенотерапии – прививки проводят не ранее, чем через 6 мес после окончания лечения.

Системные заболевания соединительной ткани.

Злокачественные новообразования и злокачественные болезни крови.

Распространенные рецидивирующие заболевания кожи (при накожной иммунизации).

Хронические заболевания органов дыхания (при ингаляционной иммунизации). Аллергические заболевания (бронхиальная астма, анафилактический шок, отек Квинке в анамнезе).

Беременность и период лактации.

Взаимодействие с другими лекарственными средствами.

Не допускается введение вакцины чумной живой в сочетании с применением антибиотиков стрептомицинового, тетрациклинового ряда и сульфаниламидов в терапевтических дозах одновременно и ранее, чем через 14 дней после иммунизации.

Изобретение относится к области иммунологии. Нативную культуру Y.pestis выращивают методом глубинного культивирования. Затем отбирают осадок и подвергают его микрофильтрации. Микрофильтрацию осуществляют с размером пор 0,2 мкм в режиме тангенциального потока жидкости при рабочем давлении 0,15-0,2 МПа и производительности его фильтрату 6-8 дм 3 ч -1 . Способ позволяет ускорить процесс получения концентрата микробных клеток и одновременно увеличить выход концентрата с единицы объема среды. 3 табл.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ

Изобретение относится к технологии производства медицинских иммуно-биологических препаратов, а именно к способам получения концентрата микробных клеток в производстве чумной живой сухой вакцины. Известен способ получения концентрата микробных клеток Y.pestis путем выращивания микробной массы на плотных питательных средах и смыва ее средой высушивания (Регламент производства 37-86 "Вакцина чумная живая сухая"). Общим с заявляемым способом является получение концентрата микробных клеток, пригодного для приготовления чумных вакцин. К недостаткам данного способа следует отнести необходимость смыва микробной массы с плотной питательной среды, вследствие чего в микробную взвесь попадают остатки питательной среды и продукты метаболизма, что отрицательно сказывается на качестве вакцин. Наиболее близким к заявляемому является способ получения концентрата микробных клеток в производстве вакцины чумной живой сухой (Регламент производства 377-97 "Вакцина чумная живая сухая"), предусматривающий выращивание нативной культуры чумного микроба, первичное осаждение микробной биомассы в аппарате-ферментере в течение 6 ч при температуре 18...20 o С, отбор осадка в аппарат-осадитель или 20-литровые бутыли и концентрирование осаждением в течение 18...48 ч при температуре 4...8 o С. Выход концентрата составляет 2... 3% от объема среды. Общим с заявляемым способом является получение концентрата микробных клеток, пригодного для приготовления чумных вакцин. К недостаткам данного способа следует отнести его продолжительность и относительно низкий выход концентрата с единицы объема среды. Задачей изобретения является ускорение процесса получения концентрата микробных клеток с одновременным увеличением выхода концентрата с единицы объема среды. Поставленная задача достигается тем, что концентрирование микробной массы осуществляют путем микрофильтрации культуры чумного микроба через мембраны с размером пор 0,2 мкм в режиме тангенциального потока жидкости. Сравнение существенных признаков предлагаемого технического решения и прототипа показывает, что общим для них является процесс культивирования микробных клеток в жидкой питательной среде, а также процесс первичного осаждения биомассы непосредственно в аппарате-ферментере. Отличием предлагаемого способа является то, что процеcc получения концентрата микробных клеток в производстве чумных вакцин осуществляют путем микрофильтрации культуры чумного микроба в режиме тангенциального потока жидкости через мембраны с размером пор 0,2 мкм. Возможность использования микрофильтрационного концентрирования микробных клеток в производстве чумных вакцин установлена нами экспериментальным путем и неизвестна из доступных источников информации. Сущность предложенного способа заключается в следующем. Нативную культуру вакцинного штамма чумного микроба после завершения процесса культивирования оставляют в аппарате-ферментере для первичного осаждения на 6 ч. Осаждение проходит при температуре 18...20 o С. Далее отбирается образовавшийся осадок в 20-литровые бутыли и подвергается микрофильтрации на мембранах с размером пор 0,2 мкм при температуре 18...20 o С, рабочем давлении 0,15. ..0,2 МПа, производительности по фильтрату 6...8 дм 3 ч -1 . Характеристика концентрата микробных клеток, полученного указанным способом, представлена в табл.1. В качестве образца сравнения дана характеристика осадка микробных клеток способа-прототипа по РП 377-97. По результатам, представленным в табл.1, видно, что концентрат микробных клеток, полученный с использованием метода микрофильтрации, по своей характеристике не уступает приготовленному традиционным способом и соответствует требованиям НТД. Наличие причинно-следственной связи между совокупностью существенных признаков заявляемого объекта и достигаемым техническим результатом, представлено в табл.2. Изобретение позволяет получать концентрат микробных клеток, по своим физико-химическим и биологическим характеристикам пригодный для использования в производстве чумных вакцин. Возможность осуществления заявляемого изобретения показана следующими примерами. Пример 1. Получение концентрата микробных клеток. Нативная культура Y. pestis штамма ЕВ, выращенная методом глубинного культивирования в аппарате-ферментере V=0,250 м 3 в течение 27 ч при температуре 26...28 o С, имеет следующие характеристики: рН=7,4 ед. рН, концентрация микробных клеток (по ОСО мутности ГИСК им. Л.А.Тарасовича) 40 млрд. кл. мл -1 , ПМФ отсутствует. После завершения процесса культивирования микробную суспензию оставляют в аппарате-ферментере на 6 ч при температуре 18...20 o С. Затем отбирают осадок в объеме 40 л в две 20-литровые бутыли и подвергают его микрофильтрации на ультра- микрофильтрационной установке "Сартокон-мини" через мембраны с размером пор 0,2 мкм при температуре 18...20 o С, рабочем давлении 0,15. . . 0,2 МПа, производительности по фильтрату 6...8 дм 3 ч -1 . В процессе фильтрации, после сокращения объема микробного осадка втрое, через каждые 10 мин отбирают стерильно пробы в объеме 5 мл для определения концентрации микробов по ОСО мутности ГИСК им. Л.А.Тарасовича. При достижении концентрации 150. . .170 млрд. кл. мл -1 процесс микрофильтрации прекращают. Общая продолжительность концентрирования двух 20-литровых бутылей составляет 12. . .18 ч. Выход концентрата микробных клеток 8...10 л (3,5...4% от объема среды). Пример 2. Концентрирование выбракованного полуфабриката чумной вакцины (по концентрации микробных клеток). Культивирование микробов Y. pestis проводится как указано в примере 1, однако вследствие ряда причин не удается вырастить нативную культуру с требуемой по регламенту концентрацией микробных клеток (по ОСО мутности ГИСК им. Л. А.Тарасовича), что приводит к выбраковке данной культуры. Применение метода микрофильтрации позволяет сконцентрировать нативную культуру с низким содержанием микробных клеток до микробной взвеси с требуемой концентрацией. Первичное осаждение и микрофильтрация проводятся, как указано в примере 1. Продолжительность процесса микрофильтрационного концентрирования составляет 10. . . 14 ч. Выход концентрата микробных клеток 4...5 л (1,5...2% от объема среды). Пример 3. Концентрирование плохоосаждаемых (седиментационно-устойчивых) культур. Культивирование микробов Y.pestis проводится, как указано в примере 1. Нативная культура по своим характеристикам соответствует требованиям регламента, но при осаждении в аппаратах-осадителях или 20-литровых бутылях по истечении 48 ч осадок не сформирован, что не позволяет получить микробную взвесь с требуемой концентрацией микробов. Весь объем неосаждаемой культуры подвергают микрофильтрации, как указано в примере 1, что позволяет получить микробную взвесь с требуемыми характеристиками. Выход концентрата микробных клеток составляет 8...10 л (3,5...4% от объема среды). Пример 4. Характеристика вакцины чумной живой сухой, приготовленной с применением заявляемого способа получения концентрата микробных клеток и способа-прототипа. Характеристика вакцины чумной живой сухой, приготовленной с применением заявляемого способа получения концентрата микробных клеток и способа-прототипа, дана в табл.3.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способ получения концентрата микробных клеток в производстве чумных вакцин, предусматривающий осаждение биомассы в аппарате-ферментере и концентрирование, отличающийся тем, что концентрирование осуществляют микрофильтрацией через мембраны с размером пор 0,2 мкм в режиме тангенциального потока жидкости при рабочем давлении 0,15-0,2 МПа и производительности по фильтрату 6-8 дм 3 ч -1 .

Торговое наименование препарата

Вакцина чумная молекулярная

микроинкапсулированная (ВЧММ).

Группировочное наименование: Вакцина для профилактики чумы.

Лекарственная форма

лиофилизат для приготовления суспензии для подкожного введения.

Состав

Одна доза для подкожного введения (0,5 мл) содержит:

Действующие вещества:

Антиген рекомбинантный F1 - от 25 до 30 мкг.

Антиген рекомбинантный V - от 25 до 30 мкг.

Вспомогательные вещества: полилактид от 4 до 6 мг; поливиниловый спирт от 0,9 до 1,1 мг; гидроокись алюминия от 0,076 до 0,129 мг; поливинилпирролидон от 1,9 до 2,1 мг; полисорбат 80 от 1,2 до 1,35 мг; фосфатно-солевой буфер от 0,25 до 0,35 мг; тиомерсал от 30 до 60 мкг.

Описание: пористая масса серовато-белого цвета. Восстановленный препарат - гомогенная суспензия серовато-белого цвета без посторонних примесей, осадка или хлопьев.

Фармакотерапевтическая группа

МИБП-вакцина.

Код ATX: J07AK

Фармакологические свойства

ВЧММ стимулирует выработку клеточного и гуморального иммунитета к антигенам F1 и V Yersinia pestis. Капсульный антиген FI (Cafl), являющийся

компонентом ВЧММ, играет важную роль в защите клетки К pestis. от захвата интактными нейтрофилами организма хозяина. С другой стороны, размножение клеток К pestis внутри макрофагов является обязательным этапом патогенеза чумы, а вирулентность чумного микроба коррелирует не с устойчивостью к захвату фагоцитами, но со способностью выживать и размножаться в фаголизосомах фагоцитарных клеток за счет подавления антибактериальных функций фагоцитов. Кроме того F1 истощает систему комплемента за счет избирательной активации С"2 и С"4 компонентов системы комплемента сыворотки человека и таким образом препятствует комплемент-опосредованной опсонизации бактерий. Показана его ведущая роль в создании напряженного иммунитета у белых мышей, крыс, приматов и человека. Основное значение в формировании иммунитета к чуме принадлежит клеточным иммунным процессам и, главным образом, Т-системе лимфоцитов. F1 индуцирует выработку макрофагами интерлейкина-1 и фактора некроза опухолей; наибольшим защитным действием обладает препарат F1, содержащий углеводный компонент, причем лучший эффект оказывает агрегированная форма капсульного антигена.

V антиген (LcrV) является важным фактором патогенности чумного микроба и обладает антифагоцитарной активностью. Он представляет собой белок, включающий 326 аминокислотных остатка, что соответствует молекулярному весу в 37,2 кДа. В состав вакцины входит рекомбинантный полипептид LcrV (G113), в котором произведена замена триптофана в позиции 113 (W113) на глицин. В экспериментах на животных показано, что рекомбинантный белок вызывает более выраженный иммунный ответ у животных по сравнению с другими исследованными структурными вариантами белка LcrV. У животных, вакцинированных LcrV (G113), титры антител достигали 1:254000, а индекс иммунитета (отношение величины LD 50 ,

_ рассчитанном для вакцинированных животных, к аналогичному показателю, рассчитанному для интактных животных) составил 5,7x10 5 .

Иммунологические свойства. По данным клинических исследований

вакцина чумная молекулярная микроинкапсулированная после двукратного применения с интервалом в 21 сутки (на 42 сутки после первичной иммунизации и на 21 сутки при ревакцинации) вызывает формирование у людей специфического иммунитета продолжительностью не менее 6 месяцев и вызывает иммунный ответ и сероконверсию: к F1 антигену в 70 % и 55 % случаев, соответственно, к V антигену - в 40 % и 20 % случаев соответственно. Титры специфических иммуноглобулинов G к F1 и V антигенам в крови вакцинированных людей могут достигать 1:800 и 1:3200, соответственно. Вакцинация приводит к повышению числа Т- и В-лимфоцитов, уровней сывороточных IgM и IgG, а также уровней спонтанных и индуцированных интерферона-у и интерлейкина-4.

Фармакодинамика и фармакокинетика

Исследования не проводились.

Показания к применению

Вакцина показана для профилактики чумы лицам в возрасте от 18 до 58 лет военнослужащим спецподразделений РХБ защиты ВС РФ (Войска радиационной, химической и биологической защиты Вооружённых Сил Российской Федерации).

Противопоказания

Повышенная чувствительность ко всем компонентам, входящим в

состав препарата;

Острые инфекционные и неинфекционные заболевания, хронические заболевания в стадии обострения - прививки проводят не ранее, чем через один месяц после выздоровления (ремиссии);

первичные и вторичные иммунодефицитные состояния, подтверждённые документально иммунологическими исследованиями;

Аллергические заболевания (отек Квинке, бронхиальная астма, крапивница, экзематозные проявления и другие аллергические заболевания);

Системные заболевания соединительной ткани;

Злокачественные новообразования и злокачественные болезни крови;

Болезни эндокринной системы;

В каждом отдельном случае при заболеваниях, не содержащихся в настоящем перечне, вакцинация проводится лишь по разрешению соответствующего врача-специалиста.

С целью выявления противопоказаний врач (фельдшер) в день прививки проводит опрос и осмотр прививаемого с обязательной термометрией.

Меры предосторожности при применении

Учитывая возможность развития анафилактического шока у отдельных высокочувствительных лиц, вакцинированный должен находиться под медицинским наблюдением не менее 30 минут. Места проведения прививок должны быть обеспечены средствами противошоковой терапии.

Меры предосторожности для персонала.

Введение вакцины проводится в условиях прививочного кабинета, оборудованного согласно СП 3.3.2342-08 «Обеспечение безопасности иммунизации», СП 3.3.2367-08 «Организация иммунопрофилактики инфекционных болезней. Санитарно-эпидемиологические правила», МУ 3.3.1891-04 «Организация работы прививочного кабинета детской поликлиники, кабинета иммунопрофилактики и прививочных бригад», МУ 3.3.1889-04 «Порядок проведения профилактических прививок». Вакцинацию проводят медицинские работники, обученные правилам организации и технике проведения прививок, а также приемам неотложной помощи в случае возникновения поствакцинальных осложнений.

При случайном введении вакцины необходимо место укола обработать 70 %-ным раствором этилового спирта, предварительно выдавив каплю крови из места укола или пореза.

Применение при беременности и в период грудного вскармливания

Противопоказано использование ВЧММ на протяжении всего срока беременности.

Клинические исследования влияния вакцины ВЧММ на грудных детей при введении вакцины кормящим матерям не проводилось.

Способ применения и дозы

Первичная иммунизация проводится двукратно по одной дозе (0,5 мл) с интервалом в 21 сутки. Препарат вводят подкожно в верхнюю треть наружной поверхности плеча после обработки кожи 70 %-ным этиловым спиртом. Для прививок используют одноразовые стерильные шприцы и иглы.

Ревакцинацию проводят по показаниям (работа в природных очагах чумы, при научно-исследовательской работе с вирулентными штаммами возбудителя чумы), не ранее чем через 8 месяцев после первичной двукратной вакцинации, однократно одной дозой.

Побочные действия

Возможные нежелательные реакции.

Прививки могут сопровождаться как местной, так и общей реакциями, интенсивность которых зависит от индивидуальных особенностей привитых.

Местные реакции проявляются в виде гиперемии, болезненности, инфильтрата, которые возникают у 55 % вакцинированных лиц на 1-3 сутки и проходят самостоятельно через 18-24 часа.

Общие реакции. После введения вакцины у 15% могут возникнуть головные боли слабой интенсивности.

Взаимодействие с другими лекарственными средствами

Допускается одновременное введение вакцины ВЧММ с доксициклином в дозе до 200 мг в сутки. Взаимодействие с другими лекарственными средствами и вакцинами не изучалось.

Особые указания

Вакцину можно вводить не ранее чем через 30 суток после последнего приема препаратов иммуноглобулинов.

Перед началом вакцинации тщательно осматривают флакон до и после разведения. Вакцина не подлежит применению при обнаружении в стекле трещин, хлопьев, не разбивающихся при встряхивании, а также при наличии посторонних примесей, с истекшим сроком годности, без этикеток и с недостающими сведениями на этикетках.

Вскрытие ампул с растворителем и процедуру введения препарата осуществляют при соблюдении правил асептики и антисептики. Разведенная вакцина может быть использована в течение одного часа. Не допускается перенос растворенной вакцины из одного помещения в другое. Неиспользуемую вакцину уничтожают согласно СаиПиН 2.1.7.2790-2010 «Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами».

После снятия с металлического колпачка флакона центральной части, тщательно обрабатывают 70 %-ным этиловым спиртом наружную часть резиновой пробки. Ампулу с растворителем вскрывают и шприцом набирают 1,8 мл. Затем прокалывают резиновую пробку иглой и вводят растворитель.

После внесения растворителя иглу вынимают и тщательно перемешивают содержимое флакона, интенсивно встряхивая флакон в течение 3 минут. Готовая к применению суспензия должна быть серовато-белого цвета.

Для прививок используют одноразовые стерильные шприцы и иглы. После растворения в шприц следует набирать только одну прививочную дозу 0,5-0,6 мл (перед инъекцией необходимо постучать по шприцу для высвобождения пузырьков воздуха, удерживая его в вертикальном положении, осторожно надавливая на поршень, пока в шприце не останется 0,5 мл суспензии). Суспензия готова для немедленного введения. Вакцину вводят глубоко подкожно в верхнюю треть наружной поверхности плеча после обработки кожи 70 %-ным этиловым спиртом. Первичная иммунизация проводится двукратно по одной дозе (0,5 мл) с интервалом в 21 сутки.

Форма выпуска

Вакцина - по 3 дозы во флаконе вместимостью 3 мл из стекла закрытых пробками из резины медицинской и алюминиевыми колпачками. По 3 флакона в пачке в комплекте с водой для инъекций в стеклянных или пластиковых ампулах (3 ампулы по 2 мл) и Инструкцией по применению.

Влияние на способность управлять транспортными средствами и механизмами

Исследования не проводилось.

Срок годности

3 года. Не применять по истечению срока годности.

Условия хранения

и транспортирования

При температуре от 2 до 8 °C в соответствии с СП 3.3.2.3332 16.

Хранить в недоступном для детей месте.

Условия отпуска

Отпуск для лечебно-профилактических учреждений.

Производитель

/ организация, принимающая претензии:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «48 Центральный научно-исследовательский институт» Министерства обороны Российской Федерации (ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России), Россия, 141306, Московская область, г. Сергиев Посад-6, ул. Октябрьская д. 11.

Адрес производства:

НИЦ (войсковая часть 23527 г. Киров) 48ЦНИИ Минобороны России,

Сотрудники Саратовского филиала Федерального исследовательского центра вирусологии и микробиологии изучили, какие антитела и механизмы клеточного иммунного ответа активирует чумная живая вакцина у человека. Они выяснили, что присутствие в крови испытуемых специфических антител к белку Pla (активатору плазминогена чумы) служит надежным показателем успешной вакцинации. Научная опубликована в журнале PLoS Neglected Tropical Diseases .

Чума - это инфекционное заболевание, вызываемое бактерией Yersinia pestis (чумной палочкой). Инфекция переносится блохами, живущими на грызунах, в том числе на обильно населяющих города крысах. В прошлом чума уничтожала европейцев миллионами. За последние несколько десятилетий число случаев заражения удалось существенно снизить с помощью вакцинации. Однако это заболевание по-прежнему часто встречается в развивающихся странах. Чтобы препятствовать его распространению, необходимо хорошо понимать, как работает чумная вакцина, и повышать ее эффективность.

Саратовские биологи начали масштабную работу по выявлению механизмов действия живой чумной вакцины. Для этого они взяли образцы крови у 34 добровольцев 26-72 лет, неоднократно привитых против чумы втиранием взвеси живых микробов в специально поврежденную кожу, а также у 17 здоровых непривитых людей того же возраста. Позже людей первой группы разделили на тех, кто проходил вакцинацию менее чем за год до анализа крови (13 человек), и тех, кому делали прививку за год и более до участия в этом исследовании (остальные 21). Ученых интересовало состояние мононуклеарных лимфоцитов в крови испытуемых. Эти клетки обеспечивают иммунный ответ на вторжение в организм различных бактерий, в том числе и чумной палочки.

Исследователи определили, в каких количествах мононуклеарные лимфоциты привитых и непривитых от чумы граждан выделяют вещества, помогающие бороться с бактериями: гамма-интерферон (IFN-γ), фактор некроза опухоли альфа (ФНО-α), а также интерлейкины 4, 10 и 17А. Перед определением содержания названных молекул в мононуклеарных клетках кровь очистили от следов живой чумной вакцины - клеток Yersinia pestis и их фрагментов. В полученные от каждого испытуемого «очищенные растворы» мононуклеарных лимфоцитов добавили белок Pla - активатор плазминогена чумы, фермент чумной палочки, способствующий ее распространению по организму инфицированного и подавление иммунной реакции на Yersinia pestis .

Оказалось, что мононуклеарные лимфоциты вакцинированных выделяют существенно больше интерлейкинов 4 и 10, а также ФНО-α и IFN-γ в ответ на присутствие Pla. Клетки из крови привитых менее года назад были чуть более активны, чем лимфоциты привитых ранее, но эта разница не была статистически значимой. Тем не менее по какой-то причине мононуклеарные лимфоциты не вакцинированных от чумы испытуемых при наличии Pla производят в 3,4 раза больше интерлейкина-4, чем аналогичные клетки из крови привитых. И чем больше раз человеку вводили живую чумную вакцину в прошлом, тем меньше интерлейкина-4 в эксперименте вырабатывали его лимфоциты.

Также исследователи определили в крови испытуемых уровни антител из различных классов иммуноглобулинов, реагирующих на присутствие активатора плазминогена чумы Pla. Многие из них связывались не только с Pla, но и с другими белками. Когда ученым удалось выделить именно те антитела, которые реагируют только на присутствие Pla, оказалось, что больше всего их образуется у тех, кто был вакцинирован относительно давно. Как и в случае с интерлейкином-4, многократные прививки против чумы приводили к тому, что антител из подклассов иммуноглобулинов G1 и G2 в ответ на активатор плазминогена чумы вырабатывалось меньше. Однако в крови многократно привитых в присутствии Pla обнаруживали специфические антитела к этому белку из подкласса иммуноглобулинов G3, а у невакцинированных их не встречали. Напротив, антитела к активатору плазминогена чумы из подкласса иммуноглобулинов G4 присутствовали только у непривитых.

Из полученных данных авторы сделали вывод, что по иммунной реакции организма на активатор плазминогена чумы Pla можно судить об эффективности вакцинации, хотя Pla не единственное вещество, вырабатываемое чумной палочкой и провоцирующее иммунный ответ в теле человека. Однако при этом надо четко отслеживать, выделение и активация каких веществ связаны с появлением Pla в организме, а какие происходят неспецифически. Также ученые предполагают, что многократные введения живой чумной вакцины могут и не повышать эффективность защиты от чумы, так как уровень интерлейкина-4 и антител из подклассов иммуноглобулинов G1 и G2 в крови с каждой вакцинацией падает.