Трепонемные тесты на сифилис. Общее описание.

Чтобы достоверно диагностировать сифилис и выявить противосифилитические антитела в организме больного (в сыворотке крови или спинномозговой жидкости), используют особые технологии лабораторных исследований - так называемые серологические методы .

При проведении диагностических тестов на сифилис, применяются различные серологические реакции : агглютинации, преципитации, иммунофлюоресценции, связывания комплемента, иммуноферментный анализ и др. В основе всех этих серологических реакций лежит взаимодействие антигенов и антител .

Специфические серологические тесты называются трепонемными потому, что в этих тестах используются бледные трепонемы или их антигены, то есть антигены трепонемного происхождения. Цель трепонемных тестов - выявление специфических антител к антигенным структурам возбудителя сифилиса, то есть антител, направленные конкретно против самих бактерий T. Pallidum, а не против тканей организма, поврежденных трепонемой. Специфические противотрепонемные антитела класса IgM могут быть обнаружены уже в конце второй недели заболевания.

7. Ложноположительные и ложноотрицательные результаты

Положительные результаты РВ на сифилис у лиц, не страдающих этим заболеванием, называют ложноположительными. Частота ложноположительных результатов у здоровых лиц составляет 0,2-0,25 %. Если процент неспецифических ложноположительных результатов РВ у здоровых очень мал, то при некоторых заболеваниях он может быть высоким.

Все неспецифические результаты серологических реакций можно разделить на следующие основные группы:

1. Заболевания, обусловленные наличием общих антигенов у сходных возбудителей (спирохет): возвратный тиф, фрамбезия, беджель, пинта, трепонема полости рта, лептоспиры.

2. Положительные реакции, обусловленные изменением липидного обмена и изменением в глобулинах сыворотки. К ним относятся положительные результаты у беременных, больных подагрой, нарушения липидного состава в результате отравления свинцом, фосфором, после приема натрия салицилата, дигиталиса и др. В число этих реакций следует включить и положительные реакции при некоторых инфекционных заболеваниях (сыпной тиф, малярия, пневмония, лепра, эндокардит, коллагенозы, инфаркт миокарда, сотрясение мозга, онкологические заболевания, цирроз печени и др.)

3. Технические ошибки проведения. Неправильный выбор дозы комплемента, несоблюдение условий и сроков хранения реагентов, исключение из постановки реакции контрольных образцов сывороток крови, использование загрязненных пробирок и инструментов.

8. Модификация реакции Вассермана

Имеются модификации постановки реакции Вассермана в качественном и количественном вариантах, на холоде, со спинномозговой жидкостью.

Модификация РВ на холоде оказалась более чувствительной. Особенностью методики постановки реакции Вассермана на холоде является трехфазность температурных режимов, при которых протекает связывание комплемента. Эта реакция также ставится с кардиолипиновым и трепонемным антигеном.

Кроме качественной оценки РВ, имеется метод ее количественной постановки с различными разведениями сыворотки крови (1:10, 1:20, 1:80, 1:160, 1:320). Титр реагинов определяется максимальным разведением, еще дающим резко положительный результат (4+). Количественная постановка РВ имеет значение в диагностике некоторых форм сифилиса и при контроле за эффективностью терапии.

9. Область применения

В России РСКт входит в состав комплекса стандартных серологических реакций на сифилис (КСР).

Реакцию Вассермана с трепонемным и кардиолипиновым антигеном (РСКт) применяют для

• диагностики всех форм сифилиса,
• контроля за эффективностью лечения,
• обследования лиц, имевших половой контакт с больным сифилисом,
• обследования лиц с клиническим и анамнестическим подозрением на сифилис
• при профилактическом обследовании на сифилис больных психиатрических и неврологических стационаров, доноров и беременных, в том числе лиц, направляемых на искусственное прерывание беременности.

В настоящее время, приказом Министерства Здравоохранения РФ, рекомендовано заменить РСКт на более чувствительные трепонемные методы (ИФА или РПГА).

За рубежом реакция Вассермана с трепонемальным антигеном уже давно не применяется в клинической лабораторной практике и не входит в список стандартных тестов, рекомендованных Всемирной Организацией Здравоохранения.

Комплекс классических серологических реакций (КСР)

КСР - это комплекс реакций , применяемых для серодиагностики сифилиса в качестве стандартного метода. Этот комплекс реакций включает в себя реакцию Вассермана с кардиолипиновым антигеном (экстракт из сердца быка, обогащенный лецитином и холестерином) и трепонемным антигеном (обработанная ультразвуком взвесь апатогенных культуральных бледных трепонем), а также микрореакцию преципитации (РМП) с плазмой или инактивированной сывороткой, которая ставится с кардиолипиновым антигеном

КСР становятся положительными в середине первичного периода (его деление на серонегативный и серопозитивный как раз и определяется по КСР), во вторичном периоде КСР положительны у 98-100% больных, а при третичном – лишь у 60- 70%. То есть, по мере увеличения давности заболевания позитивность КСР постепенно снижается.

Достоинства КСР:

1) Дешевизна, простота и быстрота постановки. Особенно это характерно для реакции микропреципитации: РМП в настоящее время – главный скрининговый (отборочный) метод;

2) Нетрепонемные тесты удобно использовать для контроля излеченности сифилиса.

Недостатки КСР:

1) Субъективность оценки результатов реакций («на глаз»);

2) Малая чувствительность при поздних формах сифилиса;

3) Недостаточная специфичность по сравнению с более современными тестами. При их проведении часто отмечаются ложноположительные реакции (ЛПР).

ЛПР могут быть обусловлены перекрестной реактивностью между бледной спирохетой и другими микробами, нарушениями липидного и белкового обмена, нестабильностью клеточных мембран, образованием аутоантител. ЛПР отмечаются при острых (малярия, инфекционный мононуклеоз и др.) и хронических (туберкулез, лепра, гепатит, боррелиоз и др.) инфекциях, инфаркте миокарда, циррозе печени, коллагенозах (особенно – при СКВ), онкопатологии, вакцинации, употреблении наркотиков, злоупотреблении алкоголем и жирной пищей. Ложноположительными могут быть КСР в последние недели беременности, после родов, а у некоторых женщин и во время месячных. Ложноотрицательные результаты КСР могут быть связаны с ВИЧ-инфекцией.

РИТ, РИБТ - Реакция иммобилизации бледных трепонем

Реакция иммобилизации бледных трепонем (РИБТ; Treponema pallidum immobilization test, TPI) - классический метод, который служит для выявления специфических трепонемных антител. Реакция РИБТ использует в качестве антигена патогенные бледные трепонемы T. pallidum (штамм Nichols), выращенные в яичке кролика. РИБТ основывается на потере подвижности живых бледных трепонем после воздействия антител из сыворотки крови пациента и комплемента. Результаты оцениваются посредством темнопольной микроскопии. Несмотря на то, что тест РИБТ был введен в клиническую практику в качестве специфического теста на сифилис, он является трудоемким, технически сложным, времязатратным и дорогим в применении.

1. История метода РИБТ

Реакция иммобилизации бледных трепонем (РИБТ) является фактически первым специфическим тестом для диагностики сифилиса. Эта реакция была представлена в 1949 году американскими исследователями Нельсоном и Майером (R. W. Nelson и M. M. Mayer) и подробно рассмотрена в научных работах в последующие десятилетия. Безуспешные попытки использовать живые трепонемы в тестах предпринимались и раньше. Благодаря тому, что Нельсону удалось создать среду, в которой трепонемы сохраняли жизнеспособность до 8 дней, его исследования увенчались успехом.

2. Принцип метода РИБТ

Метод основан на феномене потери бледными трепонемами подвижности в присутствии иммобилизирующих противотрепонемных антител исследуемой сыворотки крови и комплемента в анаэробных условиях. Антигеном служат живые патогенные бледные трепонемы, полученные от искуственно зараженных сифилисом кроликов.

3. Постановка теста РИБТ

В реакции участвуют испытуемая сыворотка, комплемент и антиген. К живым трепонемам, полученным из тканей яичка кролика после искусственного заражения, добавляют сыворотку крови исследуемого. При наличии в сыворотке противотрепонемных антител-иммобилизинов, бледные трепонемы прекращают движение (иммобилизируются). Антитела-иммобилизины относятся к поздним антитрепонемным антителам.

Реакция ставится с инактивированными прогреванием сыворотками или с образцами сывороток, высушенных на вощеной бумаге (сухие капли). Инактивацию сыворотки прогреванием проводят 30 минут при температуре 56°С. Перед взятием крови обследуемый не должен получать медикаменты, особенно препараты пенициллина. Прием препаратов отменяют на срок их возможной задержки в организме.

В качестве антигена используются бактерии штамма Никольса, полученные из 7–10-дневного кроличьего сифилитического орхита (воспаления яичка). Период от момента постановки реакции до регистрации ее результатов длится 18-20 часов, поэтому для сохранения жизнеспособности и хорошей подвижности микроорганизмов необходима среда выживания.

В РИБТ применяют комплемент морских свинок. Для получения комплемента кровь берут обязательно в условиях стерильности у нескольких морских свинок.

В случае бактериального загрязнения комплемент бракуют. Нельзя применять в реакции иммобилизации бледных трепонем консервированный комплемент, т.к. он токсичен для микроорганизмов.

В реакции иммобилизации используют избыток комплемента. Количество его в значительной степени зависит от среды выживания для бледных трепонем.

РИБТ ставят в стерильных боксах, предварительно облученных бактерицидной кварцевой лампой в течение 45-60 минут. Каждую сыворотку крови исследуют в двух пробирках: опытной и контрольной . В обе пробирки вносят исследуемую сыворотку и антиген в необходимых количествах. В опытную пробирку наливают активный комплемент, а в контрольную такое же количество инактивированной сыворотки крови морской свинки. После заполнения содержимое пробирок перемешивают легким встряхиванием.

РИБТ протекает в анаэробных условиях. Пробирки с ингредиентами помещают в микроанаэростат, из которого вакуумным насосом отсасывается атмосферный воздух и нагнетается газовая смесь из баллона (95 частей азота и 5 частей углекислого газа). Микроанаэростат с пробирками помещают в термостат (35°С) на 18-20 часов.

Оценку результатов РИБТ производят после извлечения пробирок из термостата и микроанаэростата (т.е. через 18-20 часов опыта). Пастеровской пипеткой на предметное стекло наносят каплю содержимого пробирки, которую накрывают покровным стеклом и исследуют в темном поле микроскопа (объектив 40, окуляр 10X). Просматривают несколько полей зрения в разных участках препарата, подсчитывая в каждом число подвижных и неподвижных бледных трепонем. Подсчет начинают с препарата из контрольной, а затем из опытной пробирки.

При постановке реакции применяют 5 контрольных исследований: с заведомо положительной и отрицательной сыворотками крови, с активным и инактивированным комплементом и средой выживания для бледных трепонем. Контрольную отрицательную сыворотку крови применяют для суждения о степени подвижности бледных трепонем в данном опыте. Контрольную положительную сыворотку крови - для оценки степени иммобилизирующей активности в условиях данного опыта. Исследование активного и инактивированного комплемента и среды проводят для определения их влияния на подвижность бледных трепонем.

При недостатке комплемента в опыте, иммобилизирующие антитела не проявляют свою активность должным образом и трепонемы остаются подвижными. Поэтому, после опыта проводят определение остаточного комплемента, чтобы оценить, не была ли подвижность бледных трепонем в опытных пробирках обусловлена отсутствием комплемента. Для этого применяется гемолитическая система - выдержанная в термостате смесь из взвеси эритроцитов барана и разведённой гемолитической сыворотки.

Остаточный комплемент определяют добавлением в каждую пробирку гемолитической системы в нужном объеме. Пробирки помещают в термостат при 37° на 45 минут. В опытных пробирках должен наступить гемолиз эритроцитов, в контрольных должна быть задержка гемолиза. Отсутствие в опытных пробирках гемолиза указывает на недостаточное количество комплемента, в этих случаях исследование надо повторить. Повторное исследование сыворотки крови не производят только в том случае, если отмечена 100% иммобилизация бледных трепонем.

4. Учет результатов РИБТ

Подсчет утративших подвижность, иммобилизованных трепонем ведется под микроскопом, методом темнопольной микроскопии. От исследователя требуется навык оценки движения трепонем. Ему следует обращать внимание на интенсивность движений, совершаемых бледной трепонемой. У этой бактерии не всегда можно наблюдать волнообразные сокращения и сгибательные движения, иногда только вращательные. Следует также уметь отличать активные движения трепонем от движения с током жидкости.

Для оценки результатов реакции рассчитывается процент иммобилизации бледных трепонем, т. е. соотношение подвижных и неподвижных трепонем в опыте (с активным комплементом) и контроле (с неактивным комплементом) по формуле:

X = (М – С)×100/М

где М - количество подвижных трепонем в контроле; С - количество подвижных трепонем в опыте; X - % иммобилизации. В практической работе процент иммобилизации определяют по заранее составленной таблице с применением вышеуказанной формулы.

Реакция иммобилизации бледных трепонем оценивается как

• положительная при иммобилизации 51 - 100% трепонем,
• слабоположительная: 31 - 50% неподвижных трепонем,
• сомнительная: 21 - 30% неподвижных трепонем,
• отрицательная: 0 - 20% неподвижных трепонем.

Реакция иммобилизации бледных трепонем становится положительной в конце первичного – начале вторичного периода сифилиса (с 7-8-й недели от момента заражения и более). Вместе с тем РИБТ малопригодна для диагностики ранних стадий сифилиса, поскольку антитела, иммобилизирующие бледные трепонемы и определяемые в реакции, появляются только через 3-6 недель после заражения. Антитела-иммобилизины относятся к классу иммуноглобулинов IgG. Они появляются в крови позже реагинов (антикардиолипиновых антител), позже антител-флюоресцинов (выявляются РИФ и ИФА) и преципитинов (выявляются РМП).

В дальнейшем РИБТ остается положительной. Отмечается высокая чувствительность реакции при поздних формах сифилиса. При вторичном, позднем сифилисе, нейросифилисе, врожденном сифилисе положительный результат РИБТ регистрируется в 95–100 % случаев. При третичном сифилисе, при специфических поражениях внутренних органов, нервной системы, когда РВ часто отрицательная, РИБТ дает положительные результаты в 98 - 100% случаев.

РИБТ долгое время признавалась самым специфичным тестом на сифилис. По данным литературы, специфичность РИБТ равна 99 %, чувствительность колеблется от 79 до 94 %. По данным ЦНИКВИ, чувствительность РИБТ (суммарно, по всем стадиям сифилиса) составляет 87,7%.

7. Область применения метода

Сфера применения РИБТ постепенно сужается из-за длительности постановки, дороговизны и трудоемкости. РИБТ - это достаточно сложный и затратный анализ, требующий высокой квалификации персонала и наличия вивария. В связи с этим применение данного метода в последние годы существенно сократилось. В США этот тест в настоящее время применяется только в исследовательских лабораториях.

Исходя из сложности и дороговизны РИФ и РИБТ, имеет смысл применять их для диагностики поздних и скрытых форм сифилиса. РИБТ сохраняет свои позиции как «реакция-арбитр» при дифференциальной диагностике ранних скрытых форм сифилиса и ложноположительных результатов. Эта реакция может быть полезн при диагностике нейросифилиса и при расхождении результатов других серологических тестов.

РИБТ становится положительной значительно позже, чем РИФ и РВ. Поэтому для диагностики заразных форм сифилиса она не применяется.

РИБТ, как и РИФ, очень медленно негативируется в процессе противосифилитической терапии. Вследствие этого она непригодна для контроля за ходом противосифилитической терапии.

Ложноположительные результаты (ЛПР) при РИБТ редки и отмечены главным образом при ряде трепонематозов (фрамбезия, пинта, беджель), не встречающихся в России, а также при лепре, саркоидозе, СКВ, туберкулезе, циррозе печени и некоторых других редких заболеваниях несифилитической природы. С возрастом пациентов число ложноположительных результатов РИБТ увеличивается.

РИБТ может оказаться ложноположительной, если в исследуемой сыворотке содержатся трепонемоцидные вещества (например, пенициллины, тетрациклины, эритромицин), вызывающие неспецифическую иммобилизацию бледных трепонем, Это может быть следствием приема трепонемоцидных антибиотиков пациентом, поэтому обследование не проводят лицам, получавшим антибиотики в течение последнего месяца. Кровь на РИБТ можно исследовать не ранее 2 недель после окончания приема антибиотиков и других противосифилитических препаратов.

9. Модификации реакции иммобилизации бледных трепонем

Помимо микроанаэростатной методики существует меланжерная постановка РИБТ по Н.М. Овчинникову. Анаэробные условия при постановке реакции создаются помещением реагирующей смеси в меланжер (лейкоцитарный смеситель), оба конца которого закрыты резиновым кольцом. Меланжерная методика реакции позволяет обходиться без вакуумного насоса, баллона со смесью азота и углекислого газа, микроанаэростата. При сравнительном изучении на большом клиническом материале получены результаты, не уступающие классической анаэростатной методике.

10. Особенности, преимущества и недостатки РИБТ

РИБТ - это технически сложный и дорогостоящий метод диагностики. Технология требует значительных средств для содержания кроликов и проведения тестирования. Этот трудоемкий тест в настоящее время он применяется в основном для научных целей. В большинстве зарубежных стран уже почти 40 лет РИБТ практически используется не для диагностических целей, а только в научно-исследовательской работе.

Недостатки реакции:

• РИБТ требует работы с живыми патогенными бледными трепонемами штамма Никольс, остающегося заразным для человека несмотря на адаптацию для кроликов
• постановка реакции сложна, трудоемка и дорогостояща
• необходимо наличия вивария
• требуется высококвалифицированный персонал для постановки реакции, учета результатов и содержания вивария
• субъективность оценки результатов
• отсутствие автоматизации
• нет возможности стандартизировать этот серологический метод.
• реакция неприменима на фоне проводимой антисифилитической терапии
• невозможность использовать для контроля излеченности. РИБТ у больных сифилисом может оставаться положительной в течении многих лет (и даже – пожизненно), несмотря на полученное полноценное лечение.
• реакция может давать ложноположительные результаты у больных злокачественными опухолями, диабетом, лепрой, аутоиммунными заболеваниями, пневмонией, тяжелой сердечно-сосудистой патологией.

Достоинствами РИБТ являются:

1) Достаточно высокая чувствительность;

2) Высокая специфичность.

РИФ (Реакция иммунофлюоресценции)

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) - метод экспресс-диагностики для выявления антигенов микробов или определения антител. Тесты, основанные на детекции флюоресцентного сигнала, считаются одними из лучших тестов на сифилис.

1. История метода

Трепонемный флюоресцентный тест - реакция иммунофлюоресценции - РИФ (Fluorescent treponemal antibody, FTA) был впервые разработан в 1957 г. Deacon и соавторами (Deacon, Falcone and Harris).

2. Принцип метода

Метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа. Бактерии в мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета

В качестве антигена в РИФ используется взвесь живых патогенных бледных трепонем штамма Никольс из орхита кролика, которая высушивается на предметном стекле и фиксируется ацетоном. К высушенным и фиксированным ацетоном к стеклу бледным трепонемам добавляется сыворотка крови больного.

После промывания препарат обрабатывается сывороткой, содержащей антитела против иммуноглобулинов человека, меченные флюоресцином. Еще раз промывают препарат и смотрят его под люминесцентным микроскопом. Если в исследуемой сыворотке есть противотрепонемные антитела-флюоресцины, будет отмечаться желто-зеленое свечение трепонем.

3. Способ проведения исследований методом РИФ

Фиксированный на предметном стекле антиген (патогенные бледные трепонемы) обрабатывается испытуемой сывороткой. После промывания препарат обрабатывается люминесцентной сывороткой против иммуноглобулинов человека, меченной флюорохромом. При этом образующийся флюоресцирующий комплекс (античеловеческий глобулин + флюоресцеин тиоизоционат) связывается с человеческим глобулином на поверхности бледной трепонемы, обеспечивая свечение бледной трепонемы под люминесцентным микроскопом.

Для выявления комплексов антиген-антитело применяют люминесцирующую сыворотку, представляющую конъюгированные с ФИТЦ антивидовые (противочеловеческие) иммуноглобулины. Наличие в сыворотке антител к трепонемам определяют по свечению трепонем при исследовании в люминесцентном микроскопе. Тест проводят в качественном и полуколичественном вариантах.

4. Учет результатов

Визуализация результатов РИФ проводится с помощью люминесцентного микроскопа. Результаты оцениваются по степени свечения трепонем в препарате. При наличии антител видно свечение трепонем, если же в сыворотке не было противотрепонемных антител, то трепонемы не видны. Степень свечения фиксированных к стеклу высушенных бледных трепонем обозначаются в «плюсах» (от «–» до «++++»). Отрицательный результат - отсутствие свечения или уровень фона - 1+.

5. При каких периодах заболевания лучше использовать

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) достаточно чувствительна на всех стадиях инфекции, с окончания периода инкубации до позднего сифилиса. Первичный период сифилиса при классическом течении начинается через 3-4 недели после заражения. РИФ становится положительной в первые дни первичного периода или даже в конце инкубационного периода, с 3-й недели после инфицирования. Результаты РИФ остаются положительными во всех периодах, в том числе при поздних формах.

РИФ становится положительной несколько раньше, чем РВ. По некоторым данным, положительная РИФ бывает у 80% больных первичным серонегативным сифилисом. Во вторичном периоде РИФ положительная почти в 100% случаев. Она всегда положительная при латентном сифилисе и дает 95 - 100% положительных результатов при поздних формах заболевания и врожденном сифилисе.

6. Чувствительность и специфичность

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) – это группа методов, обладающих высокой чувствительностью и специфичностью. РИФ чувствительна во всех стадиях инфекции, начиная от периода инкубации и заканчивая поздним сифилисом. По данным ВОЗ, чувствительность РИФ при первичном сифилисе – 70-100%, при вторичном и позднем – 96–100%, специфичность – 94–100%. По данным ЦНИКВИ, чувствительность РИФ при всех формах сифилиса составляет 99,1%.

Специфичность РИФ может быть повышена путем предварительной обработки исследуемой сыворотки сорбентом - ультраозвученным трепонемным антигеном, связывающим групповые антитела (РИФ-абс).

7. Область применения метода

РИФ применяется:

• как подтверждающая реакция при раннем, скрытом сифилисе
• при установлении ретроспективного диагноза
• для дифференциации скрытых форм сифилиса и ложноположительных результатов исследований на сифилис.
• как подтверждающий тест при нейросифилисе.

РИФ достаточно широко используют в качестве подтверждающего теста, но она не предназначена для рутинного использования или скрининга, поскольку в  техническом отношении трудна для постановки. Для выполнения РИФ необходимо наличие вивария или приобретение взвеси патогенных бледных трепонем, что ограничивает возможности реакции. Однако в последние годы на отечественном рынке начали появляться тест-системы, позволяющие проводить реакцию при отсутствии вивария и собственного лабораторного штамма патогенных бледных трепонем.

8. Источники и причины ошибок при постановке, ложноположительные и ложноотрицательные результаты

ЛПР при постановке РИФ бывают редко (при коллагенозах, боррелиозе).

РИФ до сих пор считают одним из лучших тестов на сифилис, «золотым стандартом» серодиагностики. РИФ в сравнении с РИБТ более проста в постановке,

Несмотря на высокую диагностическую ценность, широкому внедрению РИФ в повседневную практику препятствуют необходимость использования живой T. pallidum, высокая стоимость и длительность проведения исследования. Постановка реакции трудоемка. Кроме того, оценка результатов РИФ носит субъективный характер.

Достоинствами РИФ и РИБТ являются:

1) Высокая чувствительность (особенно для РИФ);

2) Высокая специфичность (особенно для РИБТ).

Недостатки РИФ и РИБТ:

1) Техническая сложность, дороговизна методов.

2) Субъективность оценки результатов, отсутствие автоматизации;

3) РИФ и РИБТ у больных сифилисом могут оставаться положительными в течении многих лет (и даже – пожизненно), несмотря на полученное полноценное лечение. Поэтому эти реакции невозможно использовать для контроля излеченности.

10. Модификации метода

На практике для серодиагностики сифилиса используется и использовалось несколько модификаций реакции иммунофлюоресценции:

• РИФ-абс – наиболее чувствительный метод серодиагностики сифилиса, становится позитивным раньше других реакций (с 3-ей недели от заражения);
• РИФ-200 (сыворотка пациента при постановке разводится в 200 раз) – высоко специфичный метод серодиагностики сифилиса.
• РИФ-10 (разведение испытуемой сыворотке в 10 раз) - более чувствительный метод, чем РИФ-200.
• РИФ-ц проводят с ликвором.
• РИФ-абс-IgM - выявление ранних противотрепонемных антител класса IgM.

1. Наибольшее распространение получила модификация РИФ-абс - реакция иммунофлюоресценции с абсорбцией. Перед постановкой реакции сыворотка обследуемого истощается смесью непатогенных трепонем для исключения перекрестных реакций. Групповые антитела удаляются из исследуемой сыворотки с помощью разрушенных ультразвуком культуральных трепонем, что существенно повышает специфичность реакции. Поскольку исследуемая сыворотка используется в разведении 1:5, то РИФ-абс отличается высокой чувствительностью.

Основными показаниями для использования РИФ-абс в клинической практике являются:

• диагностика скрытых и поздних форм сифилиса,
• выявление ложноположительных результатов КСР и РМП, особенно у беременных и соматических больных при подозрении на сифилис,
• для установления ретроспективного диагноза заболевания.

РИФ-абс мало информативна при оценке результатов лечения: у 85 % больных, получивших адекватную противосифилитическую терапию, положительные результаты РИФ сохраняются многие годы.

Эту реакцию называют «золотым стандартом» серодиагностики сифилиса. Ее используют для арбитражных случаев, но для достоверного результата необходима свежая концентрированная взвесь T. pallidum штамма Nichols из семидневного орхита у кролика, которую нельзя замораживать.

2. В СССР ставилась в двух модификациях - РИФ-10 и РИФ-200 , т. е. с разведением испытуемой сыворотки в 10 и 200 раз. РИФ-200 - исследуемая сыворотка разводится в 200 раз для уменьшения количества ложноположительных результатов. Это обеспечивает высокую специфичность реакции, но чувствительность ее несколько падает. РИФ-10 более чувствительна, но чаще дает неспецифические положительные результаты, чем РИФ-200, отличающаяся высокой специфичностью. РИФ-10 более чувствительна, РИФ-200 и РИФ-абс – более специфичны.

Чувствительность РИФ-200 и РИФ-абс оценивается 84–99 %, а специфичность - 97–99 %.

3. РИФ-ц проводят с ликвором. Реакция ставится с использованием цельной спинномозговой жидкости для выявления специфических поражений ЦНС.

4. Реакция РИФ-абс-IgM предложена для выявления ранних противотрепонемных антител класса IgM. Эта реакция может использоваться для диагностики врожденного сифилиса, ранних форм сифилиса и дифференциальной диагностики случаев реинфекции и серорецидива.

Известны 2 модификации этой реакции:

– FTA-ABS-IgM, основанная на использовании во второй фазе реакции конъюгата анти-IgM (меченные флюоресцеином антитела к IgM человека) вместо античеловеческого флюоресцирующего глобулина;

– российский вариант РИФ-абс-IgM, отличающийся тем, что к исследуемой сыворотке крови добавляется сорбент, удаляющий IgG-антитела, а с оставшимися IgM-антителами ставится РИФ-абс.

Основными показаниями к постановке РИФ-абс-IgM являются:

– серодиагностика врожденного сифилиса при отсутствии у ребенка манифестных проявлений врожденного сифилиса на коже и слизистых оболочках;

– дифференциальная диагностика реинфекции и клинико-серологического или серологического рецидива сифилиса, при котором РИФ-абс-IgM будет отрицательной, а РИФ-абс - положительной;

– оценка эффективности терапии раннего приобретенного или врожденного сифилиса: после адекватного лечения РИФ-абс-IgM становится отрицательной в течение ближайших 3–6 месяцев.

Эта реакция может использоваться для выявления врожденного сифилиса. Известно, что крупные молекулы IgM не могут проходить через здоровую плаценту. Следовательно, антитела класса М против бледной трепонемы могут появиться в организме ребенка или вследствие нарушения барьерной функции плаценты или же они вырабатываются организмом ребенка, больного сифилисом. Антитела класса IgM появляются в крови больного сифилисом уже в первые недели болезни, а антитела класса IgG появляются позже. Раздельное определение антител обоих классов оказывается исключительно полезным при диагностике врожденного сифилиса у детей, так как наличие у ребенка на первом месяце жизни антител класса IgM будет указывать, что они образованы организмом больного сифилисом ребенка, в то время как выявление только антител IgG будет говорить о материнском происхождении последних.

Постановка реакции 19S(IgM)-РИФ-абс предполагает предварительное разделение c помощью гель-фильтрации более крупных молекул 19S IgM от

фракции более мелких молекул 7S IgG. Дальнейшее исследование в реакции РИФ-абс сыворотки крови, содержащей только фракцию 19S IgM,

устраняет все возможные источники ошибок. Но техника постановки этой реакции сложная и трудоемкая, требует специального оборудования и подготовки специалистов.

Реакция иммунного прилипания (РИП, TPIA - Treponema pallida immunoadherence).

Эта реакция основана на использовании феномена, который в 1912 г. описал Rieckenberg. РИП основана на том, что вирулентные тканевые трепонемы, сенсибилизированные сывороткой больного сифилисом, в присутствии комплемента и эритроцитов прилипают к поверхности эритроцитов и при центрифугировании увлекаются с ними в осадок, исчезая из надосадочной жидкости.

Для постановки реакции используются следующие ингредиенты: испытуемая сыворотка, антиген, комплемент, эритроциты донора, изотонический раствор натрия хлорида. В качестве антигена используют взвесь бледных трепонем штамма Никольса.

Наиболее широко применительно к серодиагностике сифилиса этот тест изучался отечественными и зарубежными авторами в 50-60-е годы. Данные о ценности РИП как диагностического теста были противоречивы. Реакция требовала максимальной точности, так как при неточном разливе ингредиентов, при избытке или недостатке исследуемого материала в препарате получались недостоверные результаты.

В России обширные исследования провела Л.В. Сазонова, которая получила близкие результаты в РИП и РИТ при использовании свежеприготовленной взвеси патогенных бледных трепонем штамма Никольса. Однако применение прогретого или консервированного фенолом антигена резко искажало результаты реакции и делало антиген нестабильным. Рекомендовать данный тест для замены РИТ Л.В. Сазонова сочла невозможным.

Г.П. Авдеева, применив при изготовлении антигена другие температурный и временной режимы, получила при изучении РИП иные результаты. По ее данным, чувствительность этой реакции выше чувствительности KCP и РИТ, но несколько уступает РИФ, а специфичность РИП, РИТ и РИФ близка.

Однако отсутствие производственного выпуска антигена для РИП не позволило более широко изучить этот тест и внедрить его в практику.

РПГА-реакция пассивной гемагглютинации

Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) является распространенным серологическим тестом, прочно укоренившимся в лабораторной практике. обладает достаточно высоким уровнем эффективности при исследовании.

1. История метода РПГА

Впервые о применении РПГА для диагностики сифилиса сообщили G.Blumental и W.Bachman (1932). В 1965 г, для диагностики сифилиса была предложена реакция непрямой, или пассивной, гемагглютинации. О модификации реакции с использованием различных антигенов сообщалось Ratlev Т. в 1965 - 1967 гг. Микромодификацию РПГА предложили Сох Р.М. и соавторы в 1969 году. Первую коммерческую тест-систему разработали японские ученые Tomisava et. al. в 1969 г.

2. Принцип метода РПГА

Из подготовленной однородной взвеси эритроцитов, «нагруженных» антигенами, при добавлении исследуемой сыворотки, содержащей антитела, выпадает осадок в виде хлопьев. Полученный осадок состоит из эритроцитов, "склеенных" антителами, и называется «гемагглютинат» . Взвесь эритроцитов подготавливается заранее и поставляется в составе диагностических тест-систем.

Процесс склеивания эритроцитов, на поверхности которых присутствуют антигены, называется «гемагглютинация». Склеивание происходит под действием специфических антител (агглютининов). Реакция называется «пассивной» , т.к. собственные антигены эритроцитов не вступают в реакцию, а сами эритроциты выполняют исключительно вспомогательную индикаторную функцию.

Реакция пассивной (непрямой) гемагглютинации - это разновидность реакции агглютинации, в которой в качестве носителей антигенов используются именно эритроциты (от греч. háima - кровь), а не другие частицы. В общем случае, в реакции агглютинации под действием антител происходит склеивание и выпадение в осадок микробов или других клеток - не обязательно эритроцитов, а, например частиц латекса, бактерий или других антигеннесущих корпускулярных частиц.

При реакции пассивной гемагглютинации для диагностики сифилиса, в качестве антигена используются эритроциты барана или птиц, покрытые антигенами бледных трепонем. При добавлении сыворотки, содержащей специфические антитела, происходит склеивание эритроцитов (агглютинация).

Реакцию РПГА относят к иммунологическим методам, т.к. она основана на специфическом взаимодействии антигена патогенной бледной трепонемы с антителом. В соответствии с «теорие решетки» агглютинация является результатом «сшивки» поверхностных молекул антигена молекулами антител (иммуноглобулинов).

3. Постановка реакции пассивной гемагглютинации

РПГА ставят в пластиковых планшетах или в пробирках с разведениями сыворотки крови больного, к которым добавляют эритроцитарный диагностикум.

Процесс соединения антигена с эритроцитами называют сенсибилизацией, а полученный таким образом искусственный корпускулярный антиген - сенсибилизированными эритроцитами. Эритроцитарными диагностикумами называются эритроциты, сенсибилизированные антигеном.

Для приготовления диагностикума применяют обработанные вначале формалином, затем танином эритроциты барана или птиц (чаще куриные), которые подвергают сенсибилизации ультра-озвученным антигеном патогенной бледной трепонемы (штамм Никольса) или рекомбинантными белками бледной трепонемы (TpN15, TpN17, TpN47). Также могут использоваться эритроциты барана, сенсибилизированных ультраозвученным антигеном культуральных бледных трепонем.

Исследуется только сыворотка (не использовать плазму крови) . Не подходят гемолизированные и мутные образцы. Отрицательным контролем служат несенсибилизированные эритроциты (для исключения наличия антиэритроцитарных антител). В каждой серии постановок используют положительный и отрицательный контроль.

В лунки (ячейки) иммунологического планшета вносят образцы исследуемой сыворотки крови и тест-эритроциты. Если в сыворотке крови пациента содержатся специфические противотрепонемные антитела, то при добавлении исследуемой сыворотки в лунку с антигеном происходит образование комплексов "антиген-антитело", связанных с поверхностью носителей (эритроцитов). Визуально это проявляется склеиванием эритроцитов, т. е. гемагглютинацией, которая видна невооруженным глазом. Иммунные комплексы "антитело-антиген-эритроцит", которые под действием сил тяжести постепенно опускаются вниз, распределяются по всей поверхности дна лунки и формируют характерную картину «перевернутого зонтика».

В зависимости от количества антител, содержащихся в исследуемом образце, изображение «перевернутого зонтика» варьируется от максимального, занимающего всю поверхность дна лунки, до небольшого участка в центральной, самой низко расположенной его части (с просветлением в центре и формированием более интенсивного кольца из осевших эритроцитов по периферии).

Иммунные комплексы не образуются, если в образце нет специфических антител или при добавлении в реакцию контрольных (интактных) эритроцитов. При этом, эритроциты постепенно собираются в самой нижней точке дна лунки, формируя фигуру в виде компактного пятна или «пуговки», иногда с незначительным просветлением в центре.

Если сыворотка крови человека содержит антиэритроцитарные антитела, то «зонтик» сформируется в любом случае - как в реакции с тест-эритроцитами, так и с контрольными эритроцитами. В этом случае для выявления специфических антитрепонемных антител рекомендуют применять другие медицинские технологии.

Возможен феномен прозоны (невозможность реакции из-за избытка антител), устраняемый разведением сыворотки.

4. Учет результатов реакции пассивной гемагглютинации

Результаты РПГА учитывают визуально через 60-120 минут при постановке микрометода и через 2–4 ч или на следующий день при постановке макроварианта. При использовании более крупных (ядросодержащих) эритроцитов птиц получают более четкую картину, учет результатов проводят в более ранние сроки.

Возможно определение титра (высокий титр РПГА ≥ 1:2 560).

Результаты исследования оцениваются по 4+ системе (от «–» до «++++») по величине образовавшейся пленочки. При появлении агглютинации эритроциты располагаются на поверхности лунки в виде «зонтика», а при отрицательном результате эритроциты свободно соскальзывают вниз и скапливаются на дне в центре лунки в виде «пуговки».

Общепринятая оценка результатов РПГА:

4+ - положительная РПГА. Агглютинированные эритроциты в виде «зонтика» равномерно выстилают всю поверхность лунки;

3+ - положительная РПГА. Эритроциты выстилают всю поверхность лунки, но часть их «соскальзывает» к центру. При этом по периферии осадка формируется заметное кольцо;

2+ - слабоположительная РПГА. Эритроциты образуют пленку на небольшом участке нижней части лунки, формируя плотное кольцо из осадка эритроцитов с заметным просветлением в центре;

1+ - неопределенная РПГА, эритроциты образуют рыхлый осадок на дне лунки с нечеткими краями и незначительным просветом в центре;

(–) - отрицательная РПГА, все эритроциты лежат на дне лунки в виде компактного осадка («пуговки» или колечка) на чистом окружающем фоне (без окружающего зернистогоосаждения).

В зарубежной практике результаты РПГА также оценивают как реактивные (в случае образования агглютината), слабореактивные (если образования незначительны) и нереактивные (если не наблюдается агглютинации).

Учет результатов реакции может производиться автоматически с применением специальных анализаторов. Помимо качественного исследования, во всех тест-системах предусмотрен количественный анализ с определением титра.

5. При каких периодах заболевания лучше использовать РПГА

РПГА становится положительной в середине первичного периода (7-8 недель от момента заражения, через 3–4 недели после появления твердого шанкра) и после лечения годами сохраняется положительной.

При очень высоком уровне антител к трепонеме в исследуемой сыворотке (что наиболее характерно для вторичного сифилиса) возможен ложноотрицательный результат РПГА (так называемый феномен «прозоны»).

Специфические антитела-агглютинины выявляются в крови переболевших сифилисом людей в течение длительного времени, поэтому РПГА не может быть рекомендована для дифференциальной диагностики реинфекции или определения остроты инфекционного процесса.

РПГА не применяется для контроля излеченности, т.к. может оставаться положительной спустя много лет после выздоровления. Вместе с тем ее можно использовать как дополнительный (к РМП или к RPR) метод при контроле эффективности проведенного лечения, исследуя динамику снижения титров антител. Обязательным условием при этом является использование той же РПГА тест-системы, что и при первом (до лечения) обследовании пациента, а также проведение исследования в той же лаборатории.

6. Чувствительность и специфичность РПГА

РПГА считается высокочувствительным и специфичным тестом. Эта реакция является ценным диагностическим тестом при всех формах сифилиса, но особенно чувствительна она при поздних формах заболевания. В зависимости от стадии заболевания чувствительность РПГА колеблется. При первичном сифилисе чувствительность РПГА составляет 76% (и выше), при вторичном сифилисе – до 100%. При скрытом раннем - 97 %, при позднем сифилисе - 94 %, со специфичностью 98–100%. Более низкая чувствительность при свежих формах заболевания объясняется более поздним формированием агглютининов.

По данным ГУ «ЦНИКВИ Росздрава» чувствительность РПГА при диагностике различных форм сифилиса составила 99,4%. Большинство исследователей отмечают 98-99% специфичность РПГА.

По чувствительности и специфичности РПГА не уступает, а при поздних формах и врожденном сифилисе даже превосходит РИФ и РИБТ.

7. Область применения метода РПГА

РПГА может применяться в качестве как скринингового, так и подтверждающего теста; может быть использована в полуколичественном варианте с расчетом титра антител. Разработаны количественный метод постановки РПГА, микрометод, а также автоматизированная реакция микрогемагглютинации.

8. Особенности, преимущества и недостатки РПГА

По данным литературы, РПГА стабильно заняла лидирующее место в клинической практике в большинстве стран мира. РПГА –  наиболее  широко  используемый  тест  в  клиниках ИППП за  рубежом. 

Методика РПГА проста в выполнении, не требует специального оборудования: для ее постановки нужен лишь планшет для гемагглютинации. Исследование не занимает длительного времени; реакция высоко чувствительна и специфична. Апробация метода в клинической практике показала, что он является исключительно простым, дешевым и чувствительным. Как и ИФА, РПГА проста в исполнении, не требует высокой квалификации персонала и специального оборудования, возможна ее автоматизация.

Преимущества РПГА-теста:

• простой в постановке и интерпретации, 
• не требует специального оборудования, 
• время получения результата – 45 минут, 
• пригоден для массового скрининга (необходимо всего 25 мкл сыворотки в разведении 1:20), 
• высокая степень стандартизации, 
• наличие внутренних контролей, 
• большой срок годности, 
• приемлемая цена 
• возможность автоматизации учета. 

Следует отметить также недостатки РПГА: 

• возможность неспецифических реакций при наличии антиэритроцитарных антител, 
• отсутствие корреляции титра и стадии сифилиса,
•  более поздняя позитивация реакции на ранних стадиях сифилиса, 
• возможность ложноположительных реакций у лиц, принимавших алкоголь, наркоманов, 
• чувствительность к вибрации и температуре в лаборатории.

Преимуществами РПГА по сравнению с РИБТ и РИФ являются:

• использование промышленных тест-систем,
• возможность автоматизации реакции,
• нет необходимости работать с живой бледной трепонемой,
• отпадает потребность в виварии.

9. Источники и причины ошибок при постановке РПГА, ложноположительные и ложноотрицательные результаты

Реакция пассивной гемагглютинации является относительно несложным исследованием; при ее выполнении необходимо соблюдать все рекомендации производителей диагностикума и правила работы в клинико-диагностической лаборатории. Допущенные ошибки могут приводить к появлению и регистрации как ложноотрицательных, так и ложноположительных результатов реакции. Ложноположительные результаты РПГА могут быть обусловлены влиянием человеческого фактора и факторов биологической природы.

Ложноположительные результаты могут быть получены

• при исследовании сывороток крови пациентов с невенерическими трепонематозами,
• за счет ревматоидного фактора
• за счет перекрестно реагирующих с трепонемным антигеном антител, образующихся при различных системных или индуцированных лекарствами и наркотиками нарушениях обмена,
• из-за аномального уровня иммуноглобулинов;
• у новорожденных детей - за счет образования в организме плода или ребенка IgM-антител к IgG матери, что осложняет трактовку результатов и диагностику врожденного сифилиса.

Ошибки, вызванные влиянием фактора участия человека на исследование:

• загрязненные микропланшеты
• неправильное пипетирование
• наличие вибрации в лаборатории
• температура воздуха в лаборатории выходит за диапазон температуры: 18–25 градусов

К наиболее типичным техническим ошибкам при постановке РПГА, приводящим к получению недостоверных результатов, следует отнести:

• неточное разведение ингредиентов,
• нарушение температурного режима,
• нарушение времени инкубации реагентов,
• нарушение сроков нанесения реагентов на планшет,
• несоответствие рН растворов требуемым,
• загрязнение лабораторной посуды.

Источником ошибок при постановке РПГА могут являться и следующие технические моменты:

• исключение из постановки реакции контрольных сывороток крови;
• неравномерная концентрация эритроцитов в диагностикуме вследствие недостаточного его перемешивания перед использованием;
• нарушение сроков и условий хранения диагностикума и контрольных эритроцитов; использование наборов с истекшим сроком годности;
• использование при постановке реакций загрязненных пробирок, наконечников пипеточных дозаторов, пипеток, иммунологических планшетов, растворов;
• неточности при первичном разведении образца сыворотки крови;
• недостаточная тщательность выполнения последовательных двукратных разведений;
• несоблюдение температурного режима и времени инкубации;
• наличие посторонних вибраций и встряхиваний иммунологического планшета во время инкубации;
• нарушение методики постановки РПГА, выражающееся в отказе от выполнения исследования с контрольными эритроцитами.

Применение плазмы крови, содержащей антикоагулянты, способные вызывать неспецифическую агглютинацию эритроцитов (РПГА), может привести к получению результатов, не подлежащих трактовке.

Число ложноположительных и ложноотрицательных результатов меньше, чем при других серологических тестах. ЛПР при постановке РПГА бывают редко и возможны при трепонематозах (фрамбезия, беджель, пинта). Также, ложноположительные результаты регистрировались (в сумме менее 1 %) у наркоманов, у больных инфекционным мононуклеозом, боррелиозом, лепрой, при коллагенозах, циррозе печени, лимфосаркоме, а также у беременных.

Ложноотрицательные результаты реакции могут быть обусловлены конкуренцией между IgM- и IgG-антителами. Также ложноотрицательные результаты возможны у ВИЧ-инфицированных пациентов.

10. Модификации метода РПГА

Существует микро- и макромодификации постановки РПГА, чаще используется первая из-за экономичности, быстроты постановки и учета результатов.

Кроме того, разработан автоматический диагностический комплекс анализа изображений, что позволило производить количественную автоматическую оценку результатов и исключить субъективизм в интерпретации полученных данных. Аппаратно-программный комплекс распознает изображение, проводит обработку данных и выдает ответ в относительных единицах. 

Для автоматизации учета результатов РПГА также используются ридеры и автоматические анализаторы.

ТРРА (Treponema pallidum particle agglutination) - реакция агглютинации искусственных частиц для выявления антител к Treponema pallidum

Краткое описание теста TPPA

В настоящее время для диагностики сифилиса применяют также модификацию метода пассивной гемагглютинации - ТРРА (Treponema pallidum particle agglutination), в которой антиген бледных трепонем фиксирован на желатиновых частицах. Так как на искусственных полимерных частицах нет собственных антигенов, обусловливающих биологическую активность, то наборы для серодиагностики сифилиса на их основе имеют основания считаться более совершенными. Использование биологически инертных искусственных частиц сводит к минимуму неспецифическую агглютинацию, обычно наблюдаемую при использовании других носителей.

TPPA используется для серологической диагностики антител к различным видам и подвидам патогенных трепонем. Этот тест может использоваться для определения антител к возбудителям сифилиса, пинты, беджеля и фрамбезии.

Процедура исследования весьма проста и не требует специального оборудования - используются стандартные «U»-образные микропланшеты. В основе теста лежит агглютинация желатиновых частиц, сенсибилизированных антигенами T. pallidum, антителами, содержащимися в сыворотке крови пациента.

TPPA - это подтверждающий трепонемный тест, который удобно использовать как для исследования малого числа образцов, так и для массового скрининга. TPPA используется за рубежом в качестве подтверждающего теста и для замены микро-гемагглютинационного теста MHA-TP (microhemagglutination assay for antibodies to T. pallidum).

Чувствительность теста TPPA составляет от 85% до 100%, а специфичность - от 98% до 100%. Чувствительность TPPA для первичного сифилиса - 88%, для вторичного и позднего скрытого сифилиса 98%-100%.

Если TPPA используется для диагностики сифилиса, то антитела к другим видам трепонем (таким, как T. pallidum endemicum, pertenue, или carateum) могут вызвать ложноположительные результаты. Существует ряд методов, позволяющих удалить эти антитела из сывороточных образцов перед началом теста.

Принцип теста TPPA

TPPA - это метод пассивной агглютинации желатиновых частиц в сыворотке или плазме крови человека. Сыворотка, содержащая антитела к патогенной трепонеме, реагирует с желатиновыми частицами, сенсибилизированными антигеном бледных трепонем штамма Никольса, подвергнутых действию ультразвука. В результате реакции, в лунке планшета для микротитрования формируется гладкая пленка агглютинированных желатиновых частиц.

Если антитела отсутствуют, то частицы оседают на дно лунки планшета, формируя компактную «пуговку» из неагглютинированных частиц. Контрольные лунки с несенсибилизированными желатиновыми частицами должны также показать такую компактную «пуговку» для каждой сыворотки, то есть отсутствие агглютинации.

Применение теста TPPA

ТРРА - это тест универсального назначения, который может одинаково успешно применяться как при обязательном профилактическом обследовании групп населения на сифилис (скрининге), так и в специализированных дерматовенерологических учреждениях. Достоинством теста TPPA является его высокая чувствительность, не уступающая классическим тестам, которые до недавнего времени являлись «золотым стандартом» серодиагностики сифилиса. Среди других достоинств теста - высокая воспроизводимость, а также простота и скорость постановки реакции.

Тест TPPA применяется для подтверждения положительных результатов нетрепонемных скрининговых тестов на сифилис, таких, как тест VDRL, а также для обследования пациентов с отрицательными результатаи нетрепонемных тестов, но имеющих признаки или симптомы, указывающие на поздний сифилис. Не рекомендуется использование TPPA в качестве единственного скринингового теста на сифилис.

Кроме того, агглютинационный тест ТРРА может использоваться для исследования образцов спинномозговой жидкости при диагностике нейросифилиса. При этом, как и в отношении других серологических тестов, интерпретация результатов должна проводиться при обязательном сочетании с другими показателями и симптомами заболевания.

Результаты теста TPPA

Оценка результата происходит по системе «плюсов» - от (–) до (2+). Результаты теста видны невооруженным глазом и интерпретируются следующим образом:

Степень агглютинации	Показатель теста	Интерпретация
Агглютинированные частицы равномерно выстилают дно лунки планшета	2+	Положительный
Достоверное большое кольцо с неровными внешними полями и периферической агглютинацией	1+	Положительный
Частицы образуют компактное кольцо с просветом в центре и плавными гладкими внешними границами	±	Слабоположительный
Частицы формируют в центре лунки компактное кольцо с незначительным просветом в центре и ровной внешней границей	–	Отрицательный
Частицы формируют в центре лунки «пуговку» с ровной внешней границей	–	Отрицательный

Учет результатов производят, чтобы определить соответствие описанию выше. Образцы, показавшие неопределенный результат (±) необходимо исследовать повторно. В случае, если в нескольких тестах методом TPPA образец показывает неопределенный результат, рекомендуется провести исследование с помощью других методов.

Результаты анализа не следует рассматривать изолированно. Например, на ранней стадии инфекции число антител ещё слишком незначительно, вследствие чего TPPA и многим другим методам не хватает чувствительности. Поэтому, в случае подозрения на сифилис, даже если результаты тестов отрицательны, образцы необходимо исследовать ещё раз. Для постановки диагноза необходимо учитывать клинические симптомы, имеющиеся у пациента, клиническую историю и другие данные.

Так же, как и в реакции РПГА, для TPPA может наблюдаться феномен прозоны и ложноотрицательный результат в случае, если образец сыворотки содержит слишком высокий титр антител.

ИФА - Иммуноферментный анализ

Иммуноферментный анализ (ИФА; The enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) является одним из многочисленных методов серологической диагностики инфекционных заболеваний. Иммуноферментный анализ (ИФА) в серодиагностике сифилиса - это тест на антитела классов M, G и A (IgM, IgG, IgA) против антигенов бледной трепонемы. Возможна постановка ИФА с ликвором.

Внедрение в практику иммуноферментного анализа (ИФА) вместо реакции Вассермана и других кардиолипиновых тестов значительно повысило качество лабораторной диагностики сифилиса. Существенным преимуществом данного метода является возможность автоматизации процесса исследования, что позволяет снизить влияние человеческого фактора.

1. История метода ИФА

Основные принципы иммуноферментного анализа на поверхности твердофазного носителя разработали E.Engvar и соавтор. (1971), B.Van Weeman и A.Schuurs (1971). Разработанный ими иммуноферментный анализ впервые был предложен для диагностики сифилиса в 1975 г. J. Veldkamp и A. Visser, которые оценили потенциал этого автоматизированного теста. ИФА начал повсеместно использоваться в диагностике сифилиса в 1980-е гг., когда были разработаны и сертифицированы диагностические тесты и стандартизированы методики тестирования. В СССР методику постановки ИФА для диагностики сифилиса разработали B.Н.Беднова, А.В.Бабий и А.В.Котровский (1982, 1983).

2. Принцип метода ИФА

Иммуноферментный анализ (ИФА) по механизму реакции близок к РИФ (выявляются те же антитела). Реакцию иммуноферментного исследования относят к иммунологическим реакциям, основанным на высокоспецифическом взаимодействии антигенов бледной трепонемы с антителами больного сифилисом.

В сифилидологической практике используется в основном непрямой вариант ИФА. Принцип наиболее часто используемого непрямого варианта реакции состоит в следующем. На поверхности лунок полистиролового планшета фиксируются иммунные комплексы, образующиеся при взаимодействии антител больного сифилисом с антигенами бледной трепонемы. После этого их выявляют их в цветной реакции с помощью специфических коньюгатов и соответствующих субстратно-хромогенных добавок.

Порядок выполнения теста следующий: на твердофазный носитель с присоединенным к нему антигеном помещается сыворотка больного. При наличии в ней антител, на поверхности носителя образуется комплекс антиген-антитело. Для «проявления» результатов реакции используются антивидовые антитела к Ig человека, конъюгированные с ферментными маркерами. В случае положительной реакции фермент, присоединившийся к комплексу антиген-антитело, разлагает добавленный в систему субстрат, в результате чего развивается цветное окрашивание разной интенсивности.

В реакции определения комплекса сорбированных на твердой фазе АГ и АТ проводят с помощью антиглобулиновых антител, меченных ферментом, по цветной реакции фермента с субстратом.

В реакции определение комплекса сорбированных на твердой фазе антигенов и антител проводят с помощью антиглобулиновых антител, меченных ферментом.

ИФА представляет возможность выявления сывороточных Ig разных классов. На рынке представлены системы, позволяющие определять раздельно IgM и IgG и суммарные антитела.

Специфические антигены, применяемые для ИФА, могут иметь различное происхождение:

ультраозвученные - их получают при результате разрушения бактериальной клетки T.pallidum ультразвуком или иным методом;

рекомбинантные - их получают генно-инженерными технологиями путем внедрения в геном бактериальной клетки (например, кишечной палочки E.Coli) гена, ответственного за синтез определенного антигена T.pallidum, с последующим наращиванием бактериальной массы продуцирующего микроорганизма, разрушением этих клеток, выделением и очисткой антигена;

пептидные - получают в результате последовательного химического синтеза антигенных эпитопов белков T.pallidum.

Организм способен образовать антитела почти к любой части молекулы антигена. При нормальном иммунном ответе этого обычно не происходит. Один или несколько иммуногенных пептидов, выделенных из белкового антигена обладают особой антигенностью, и большинство антител образуется именно к ним. На них развивается наиболее интенсивный иммунный ответ. Наибольшую информативность в ИФА показали иммунодоминантные участки белков бледной трепонемы с молекулярной массой 15 кД, 17кД и 47кД. В качестве антигена использовали детергентный экстракт, или соникат патогенных трепонем штамма Никольс.

3. Способ проведения исследований методом

Принцип метода заключается в выявлении сорбированного на твердой фазе (поверхность лунок пластикового планшета) специфического комплекса антиген-антитело антиглобулиновыми антителами, меченными ферментом (пероксидазой), с помощью цветной реакции с субстратом, учитываемой количественно спектрофотометрически.

Антигены, применяемые для сенсибилизации лунок полистиролового планшета могут быть:

• лизатными - полученными в результате разрушения ультразвуком бледной трепонемы;
• пептидными - полученными в результате химического синтеза фрагментов белков бледной трепонемы и имеющими антигенную реактивность, аналогичную исходным белкам возбудителя;
• рекомбинантными - полученными с помощью методов генной инженерии, несущими антигенные детерминанты, идентичные бледной трепонеме.

В сифилидологической практике обычно используется непрямой вариант ИФА.

4. Учет результатов

При ИФА для визуализации реакции антиген-антитело используют реакцию фермента (щелочная фосфатаза или пероксидаза хрена) с субстратом, который при этом меняет свою окраску. Интенсивность окраски определяет позитивность реакции (от «–» до «++++»). Результаты ИФА могут оцениваться визуально по 4-бальной системе или инструментально в виде цифровых показателей оптической плотности, получаемых на специальных ридерах (типа Мультискан) при длине волны 492 нм. Т.к. оценка результатов проводится спектрофотометрически, это исключает субъективную интерпретацию.

5. При каких периодах заболевания лучше использовать

Сроки позитивации ИФА - с 4-ей недели от заражения. Результаты ИФА (как и РИФ) становятся положительными в первые дни первичного периода или в конце инкубации и остаются положительными во всех периодах. ИФА особенно ценен в ранней диагностике сифилиса – положительные результаты выявления антител могут быть получены уже в конце инкубационного периода заболевания (т. е. на 4–6-й неделе после инфицирования).

6. Чувствительность и специфичность

ИФА – высокочувствительный и специфичный тест, что является его преимуществом. ИФА по механизму реакции, чувствительности и специфичности близок к РИФ, т.к. в обеих реакциях принимают участие одни и те же антитела. Большинство исследователей отмечают высокую специфичность и чувствительность на всех стадиях болезни. Чувствительность различных вариантов ИФА, по данным Г. А. Дмитриева, достигает 98–100 %, а специфичность - 96–100 %. По данным ЦНИКВИ, чувствительность ИФА при сифилисе составляет 99,1% (Приказ № 87 М3 РФ).

Вариант твердофазного ИФА (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) относится к самым чувствительным серологическим реакциям, позволяя выявлять 0,0005 мкг/мл антител и 0,000005 мкг/мл антигенов.

7. Область применения метода

Метод рекомендуется использовать при обследовании беременных, контактных лиц, доноров и представителей групп риска. ИФА может применяться как в качестве скринингового, так и подтверждающего теста. За относительно короткое время своей истории, ИФА превратился из ориентировочного теста в подтверждающий. В диагностике сифилиса тест используется также как подтверждающий для образцов, демонстрирующих положительные результаты при использовании различных нетрепонемных тестов и РПГА.

Метод ИФА может быть использован в количественном варианте с расчетом индекса позитивности, или реактивности, который позволяет оценивать уровень антител в образце.

В настоящее время в России применение иммуноферментного анализа для диагностики сифилиса регламентировано Приказом Минздрава РФ №87 от 26 марта 2001 года «О совершенствовании серологической диагностики сифилиса» (приложение №1 «Постановка отборочных и диагностических тестов на сифилис»). В приказе планируется замена РСК в комплексе серореакций (КСР) на ИФА и РПГА.

8. Источники и причины ошибок при постановке, ложноположительные и ложноотрицательные результаты

Иммуноферментный анализ является сложным многоступенчатым исследованием, при котором необходимо строго соблюдать все рекомендации производителей диагностических наборов, правила регулировки и настройки применяемой в исследовании аппаратуры.

Источником ошибок при постановке ИФА могут являться следующие моменты:

Исследование в реакции гиперлипидемичной, гемолизированной сыворотки крови или образцов с признаками бактериального пророста;

Не практиковать двух- и более кратного замораживания образца биологического матери¬ала, при необходимости повторного исследования использовать сыворотку из пробирки-дубликата;

Нарушение сроков и условий хранения иммуносорбента и отмывающего раствора; использование тест-наборов с истекшим сроком годности;

Применение компонентов реакции из других диагностических наборов;

Нарушение времени проведения этапов реакции;

Высыхание лунок иммунологического планшета на этапах реакции;

Повторное использование пластиковой посуды (пластиковых лоточков) для приготовления смеси хромогена и субстрата;

Несоблюдение периодичности метрологического контроля параметров работы применяемых аппаратов (вошера и спектрофотометра);

Использование при постановке реакций загрязненной лабораторной посуды: колб, мерных цилиндров, пробирок, пипеток, наконечников пипеточных дозаторов;

Недостаточная тщательность выполнения разведений образцов биологического материала;

Ошибки при внесении образца биологического материала в соответствующую лунку планшета;

Ошибки при перенесении результатов исследования в журнал регистрации, протокол исследования или бланк ответа.

Тщательное выполнение рекомендаций инструкций по применению диагностических тест-наборов, регулярная поверка точности пипеточных дозаторов и автоматических приборов, применение внутреннего положительного и отрицательного контролей позволяют получать результаты ИФА-исследования с высокой воспроизводимостью.

9. Особенности, преимущества и недостатки

ИФА относится к современным, перспективным методам серодиагностики сифилиса ввиду его простоты, воспроизводимости, доступности. Определение антител методом ИФА является идеальным способом диагностики, подходящим для одновременного исследования большого числа образцов. Благодаря своим преимуществам, он завоевал популярность во всех странах.

Технология ИФА-исследования предусматривает соблюдение всех рекомендаций производителей коммерческих диагностических тест-наборов и тщательности выполнения процедуры исследования. Для проведения исследований в ИФА необходимо приобретение дополнительного специального оборудования. Методика постановки занимает более длительное время по сравнению с РМП, RPR и РПГА.

Наличие автоматизации ряда этапов или всего процесса в целом позволяет одновременно исследовать большое количество образцов биологического материала при высокой степени стандартизации исследования, минимизации субъективного элемента в оценке результатов, возможности хранения фиксированных протоколов исследования, что позволяет архивировать данные исследования и обращаться к ним повторно для ретроспективного анализа.

Достоинства:

• Дает возможность дифференцированного и суммарного определения IgM и IgG антител к возбудителю сифилиса.
• высокая чувствительность и специфичность, приближающиеся к 100%,
• воспроизводимость
• возможности автоматизации

К преимуществам ИФА относят высокую специфичность (96-100%) и чувствительность (98-100%), отмечаемые большинством исследователей.

Наличие автоматизации ряда этапов или всего процесса в целом позволяет одновременно исследовать поток с большим количеством образцов биологического материала при высокой степени стандартизации исследования, минимизации субъективного элемента в оценке результатов, возможности хранения фиксированных протоколов исследования, позволяющих архивировать данные исследования и обращаться к ним повторно для ретроспективного анализа.

Существенными недостатками методик, выполняемых вручную, в т. ч. определения антител к антигенам T. pallidum методом ИФА, являются:

~ возможные ошибки персонала при проведении исследования (оплошность, небрежность, нарушение технологии);

~ невозможность полной стандартизации процесса исследования при ручном варианте постановки ИФА;

~ повышенный риск заражения персонала.

10. Модификации метода

Наряду с классическим непрямым ИФА известен и метод ловушечного ИФА . Он был предложен в 1989 г. O. E. Ijsselmudien и соавт. для выявления антител класса IgM к антигенам Tr. pallidum. Метод обладает высокой специфичностью и чувствительностью.

На поверхности лунок планшета сорбированы очищенные антитела к иммуноглобулинам человека класса M, и после инкубации исследуемой сыворотки все IgM связываются с носителем. Наличие же среди связанных IgM специфичных для антигенов Tr. pallidum выявляется с помощью антигенов Tr. pallidum, конъюгированных с ферментом.

Этот метод позволяет выявлять антитела не только класса IgM, но и классов IgG, IgA. Для этого лунки планшетов сенсибилизируются аффинно очищенными антителами определенного класса против иммуноглобулинов человека. При этом из сыворотки вылавливаются антитела этого класса, а выявление трепонемоспецифических антител осуществляется путем их соединения с конъюгатом, представляющих соединение трепонемного антигена с ферментом.

Использование ловушечного варианта иммуноферментного анализа снижает риск ложноположительных реакций, опосредованных ревматоидным фактором крови, перекрестными реакциями между иммуноглобулинами классов М и G. При обследовании новорожденных в этом случае также исключаются ложноположительные результаты анализа, связанные с выявлением IgM, направленных против материнских антитрепонемных IgG.

В качестве вариантов ИФА за рубежом нашли широкое применение enzyme immune assay (EIA) и система ICE Syphilis . В последней в ячейках планшета сорбирована смесь антител к IgM и IgG, а также трех рекомбинантных белков T. pallidum. Положительные результаты тестируются в этой же тест-системе в двух повторах для выдачи окончательного результата.

В России был разработан ряд тест-систем для серодиагностики сифилиса методом ИФА с отечественными реагентами. Эти системы обладают высокой специфичностью и чувствительностью.

Помимо вышеперечисленных, существуют также другие варианты ИФА, в том числе допускающие прямое выявление возбудителя в крови (прямой ИФА), дот-ИФА с постановкой реакции на полосках нитроцеллюлозы, ИФА с капиллярной кровью, а также иммуноблоттинг, или Western Blot, с одновременным выявлением АТ к различным компонентам возбудителя.

Современной улучшенной модификацией ИФА является иммуноблоттинг.

ИХА (иммунохемилюминесцентный анализ), ИХЛ (иммунохемилюминесценция)

С развитием лабораторной диагностики в условиях модернизации здравоохранения РФ в практику лабораторий вошла автоматизация лабораторных исследований, которая позволяет стандартизовать аналитические этапы исследований. Это способствует повышению качества диагностики. С внедрением автоматизации стали применяться новые высокотехнологичные методы, обладающие высокой чувствительностью и специфичностью, такие как иммунохемилюминесцентный анализ (ИХА) (chemiluminescence immunoassay - CLIA)

Хемилюминесценция - процесс излучения фотонов при переходе электронно-возбужденных продуктов окислительных химических реакций в исходное энергетическое состояние. В ходе реакции хемилюминесценции выделяется значительное количество энергии, и квантовый выход излучаемого света достаточно высок. Из всех неизотопных методов хемилюминесценция обеспечивает наиболее высокую чувствительность. Для иммунометрических методов чувствительность хемилюминесценции на порядки превосходит чувствительность радиоиммуноанализа.

Метод иммунохемилюминесценции (ИХЛ) в настоящее время нашел свое применение при диагностике маркеров опухолей, аутоиммунных заболеваний, диабета, кардиомаркеров, гормонов (щитовидной железы, надпочечников, женских и мужских половых гормонов), torch-инфекций, вирусных гепатитов, вирусов группы герпеса.

На основе метода иммунохемилюминесценции разработан ряд высокочувствительных и специфичных (98-100%) тест-систем для диагностики сифилиса, применяемых в основном за рубежом.

В методе в качестве антигенов используются полученные генно-инженерными методами рекомбинантные липопротеины, которые являются полными аналогами антигенов T.pallidum.

Метод ИХА по результатам клинического исследования получил признание и рекомендован к применению в лабораторной диагностике сифилиса в Российской Федерации в качестве скринингового и подтверждающего теста при наличии в лабораториях соответствующего оборудования. В 2012 г. ИХА был включен в качестве скринингового и подтверждающего теста для диагностики сифилиса в Клинические рекомендации по ведению больных с инфекциями, передаваемыми половым путем, и урогенитальными инфекциями

Таким образом, использование высокотехнологичного ИХА, вошедшего в практику как мировой, так и отечественной лабораторной диагностики с внедрением автоматизации, обеспечивает следующие преимущества:

• исключение влияния субъективных факторов на аналитическом этапе исследования
• безопасность персонала при выполнении исследований потенциально инфицированного биологического материала
• повышение скорости получения результатов пациентом
• стандартизацию исследований и контроль качества исследования
• выдачу надежных достоверных результатов пациентам
• высокое качество клинических лабораторных исследований.

По чувствительности метод ИХА сопоставим с методом радиоиммунного анализа, а по простоте исполнения, безопасности для персонала и многим другим параметрам – превосходит его.

Метод ИХА, обладающий высокой чувствительностью и специфичностью (98–100%), дает возможность количественного определения уровня антител к возбудителю сифилиса, может быть использован для подтверждения сифилитической инфекции и скрининга. Ограничения применения: не может быть использован для контроля эффективности терапии, может давать ложноположительный результат.

Иммунохроматография (ИХГ).

Относительно новыми для использования в Российской Федерации являются методы выявления трепонемоспецифических антител, основанные на методах иммунохроматографии (ИХГ). Как и в методе ИХА, в качестве антигенов используются рекомбинантные липопротеины, полученные генно-инженерными методами (например: антигены Tp15, Tp17, Tp47) и биосинтетический пептид TmрА. Перечисленные антигены также используются в разных сочетаниях в составе иммуносорбентов в ИФА и иммуноблоттинге.

Метод ИХГ позволяет быстро определять содержание трепонемоспецифических антител к возбудителю сифилиса в образцах сыворотки и цельной крови без использования специального лабораторного оборудования и применяется при оказании первичной медико-санитарной помощи, в том числе по эпидемиологическим показаниям.

Ограничения применения: не может быть использован для контроля эффективности терапии,может давать ложноположительный результат.

ПБТ (простые быстрые тесты у постели больного)

Относительно недавно в серодиагностике сифилиса начало развиваться направление по разработке так называемых простых быстрых тестов (ПБТ), или тестов у постели больного (Point-of-care - РОС). Простые быстрые тесты у постели больного, или иммунохроматографические тесты позволяют проводить быстрое определение содержания трепонемоспецифических антител к возбудителю сифилиса в образцах сыворотки и цельной крови без использования специального лабораторного оборудования и применяться при оказании первичной медико-санитарной помощи, в том числе по эпидемиологическим показаниям. Ограничения применения: не могут быть использованы для контроля эффективности терапии, могут давать ложноположительный результат.

Эти тесты основаны на иммунохроматографическом определении антител к трепонемным антигенам бледной трепонемы я выполняются на стрипах; при этом можно использовать как цельную кровь, так и сыворотку (Herring A., Ballard R. et al, 2006). Формат тестов позволяет проводить исследования при отсутствии специального оборудования и без использования электричества. Однако ввиду относительно невысокой чувствительности и специфичности эти тесты пока не находят своего широкого применения в практике.

Иммуноблотинг (Western Blot)

В последние годы появились методы исследования, направленные на обнаружение и анализ содержания антител к каждому антигену бледной трепонемы раздельно. Один из таких методов - это метод иммунного блота (или блоттинга, имммуноблотинга, Western blot), который применяют для определения IgG- либо IgM-антител к бледной трепонеме. Метод иммуноблоттинга является модификацией иммуноферментного анализа - вариантом ИФА.

Имммуноблотинг является одним из самых современных методов серодиагностики сифилиса и активно используется за рубежом. Свое название ("западный блоттинг") он получил в качестве юмористического ответа на названия техник определения ДНК ("южный блоттинг") и РНК ("северный блоттинг").

1. История метода

Иммуноблоттинг (Western blot) используют для определения IgG- либо IgM-антител к антигенам бледной трепонемы (Herremans М. et al., 2007).

2. Классический иммуноблот

Классический иммуноблот (Western Blot Analysis) сочетает в себе иммуноферментный анализ и применение электрофоретического метода. Белки-антигены возбудителя сифилиса предварительно разделяют методом электрофореза и переносят на носитель - нитроцеллюлозную мембрану (стрип). Этот перенос и называется блоттингом. Затем этот носитель с разделенными точками (blots), обрабатывают исследуемой сывороткой и антителами к IgG или IgM, меченными ферментами либо радиоактивными веществами. Метод предполагает использование природных или рекомбинантных белков трепонемы.

Электрофорез - это разделение заряженных соединений на основе их подвижности в электрофоретическом поле. При наложении разности потенциалов в какой-то среде положительно заряженные молекулы движутся к отрицательно заряженному электроду, а отрицательно заряженные - к положительному электроду.

Большинство глобулярных белков собраны таким образом, что большая часть заряженных групп, а именно гидрофильных, расположена на поверхности белка, тогда как незаряженные, гидрофобные остатки погружены во внутрь глобулы. В электрическом поле в соответствии со своим зарядом белки мигрируют по направлению к противоположно заряженному электроду.

Электрофоретическое разделение белков производят в синтетический гелевой среде на основе полиакриламида. Для разделения белков в соответствии с их молекулярной массой перед началом электрофореза белковую смесь преинкубируют в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН).

Детальные исследования зарубежных ученых Weber и Osborn (1969) показали, что после такой обработки единственным фактором, который может повлиять на подвижность белков в полиакриламидном геле (ПААГ) является размер белка, а точнее его молекулярная масса. Это позволило применить метод электрофореза в ПААГ в присутствии ДСН для достаточно точного определения молекулярной массы белков и пептидов. В зарубежной литературе этот метод был назван SDS-PAGE (sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis).

Профиль реактивности в классическом WB-тесте с природными антигенами (метод электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия). (1) - контрольный положительный результат, (2) - контрольный отрицательный результат, (3-6) - клинические образцы.

В тестах на сифилис с помощью данного метода, предварительно очищенная и разрушенная до составных компонентов бледная трепонема подвергается электрофорезу в полиакриламидном или агарозном геле. При этом входящие в ее состав антигены разделяются по молекулярной массе.

Затем методом вертикального электрофореза антигены переносят на полоску нитроцеллюлозы, которая отныне содержит невидимый глазом спектр антигенных полос, характерный для бледной трепонемы.

При проведении анализа на нитроцеллюлозную полоску (стрип) наносится исследуемый материал (сыворотка, плазма крови пациента и др.). Если в пробе есть специфические антитела, то в процессе инкубации они прочно связываются со строго соответствующими (комплементарными) им антигенными полосами и образуют комплекс “антиген – антитело”.

После удаления несвязавшихся иммуноглобулинов во время отмывания стрипа следует инкубация с конъюгатом – меченными ферментом антителами к иммуноглобулинам человека (антитела к IgG или IgM человека), в ходе которой на поверхности мембраны происходит присоединение к имеющимся комплексам “антиген – антитело” антител, меченных ферментом.

После удаления несвязавшегося конъюгата в ходе инкубации с раствором субстрата происходит взаимодействие фермента с субстратом, в результате чего развивается цветная реакция – окрашивание участков мембраны (в виде полос), где располагаются отдельные антигены бледной трепонемы, антитела к которым находились в исследуемой сыворотке. Интенсивность окрашивания зависит от количества связавшихся антител из сыворотки. Результат реакции оценивается визуально.

Наличие полос на определенных участках нитроцеллюлозной пластины подтверждает присутствие в исследованной сыворотке антител к строго определенным антигенам бледной трепонемы.

Определяемые с помощью этого метода иммунодетерминанты 15, 5, 17, 44,5, 47 кД обладают диагностической значимостью при сифилисе. Ig G-иммуноблоттинг по чувствительности и специфичности подобен РИФ с абсорбцией (РИФ abs). Ig М-иммуноблоттинг может служить диагностическим тестом для врожденного сифилиса.

3. Иммуноблот в формате линейного иммунного анализа

Линейный иммунологический анализ (line immunoassay, LIA) позволяет одновременно определять антитела к антигенам бледной трепонемы в сыворотке или плазме крови человека. Антигены заранее нанесены на тест-полоски (стрипы), которые поставляются в составе коммерческих диагностических наборов.

Стрипы изготавливаются из нитроцеллюлозной мембраны, полиамидной с пластиковой подложкой или нейлоновой мембраны с пластиковой основой. При изготовлении, на тест-полоску помещают несколько дискретных антигенов в виде отдельных антигенных линий. Помимо этих антигенов сифилиса, на каждую полосу наносятся еще четыре контрольных линии: стрептавидин и контрольные пробы (3 + , 1 + и ± линия среза).

Для полосок используются искусственные антигены, полученные генно-инженерными способами - рекомбинантные белки или синтетические полипептидные конструкции. Это аналоги поверхностных антигенов бледной трепонемы - TpN15, TpN17, TpN47 и TmpA с молекулярной массой 15, 17, 47 kDа и 44,5 (ТmpА), где kDа=kiloDaltons. С их помощью определяют сывороточные антитела к различным иммунодоминантным компонентам возбудителя.

Инкубация испытательного образца проходит в кювете, куда также помещается индикаторная полоса. Антитела к T. рallidum определяются по связыванию с антигенами, нанесенными на тест-полоски. Если в образце имеются специфичные для T. pallidum антитела, они образуют связи с отдельными линиями антигенов. При взаимодействии антител, содержащихся в испытуемой сыворотке, с дискретными антигенами Т. pallidum, помещенными тест-полоску, образуется комплекс антиген-антитело в виде визуально определяемых цветных полос.

При учете результатов иммуноблотинга оценивают реактивность сыворотки к каждому из антигенов в отдельности. Суммарный положительный ответ выдается при получении результата одновременно с двумя или тремя из представленных антигенов.

Исследовательские процедуры проводятся вручную или на специальном анализаторе, с интерпретацией результатов с помощью специализированной компьютерной программы для инфекционных заболеваний.

За счет высокой степени очистки рекомбинантных антигенов и одновременного выявления антител к наиболее иммуногенным детерминантам возбудителя сифилиса, метод обладает высокой чувствительностью и специфичностью.

4. Учет результатов

Для считывания интенсивности окрашивания антигенных полос на стрипах разработаны фотометры, работа которых основана на отражении сигнала, что исключает субъективную оценку и дает потенциальную возможность автоматизации.

5. При каких периодах заболевания лучше использовать

Тесты, использующие метод иммуноблоттинга, могут определять специфические антитела к антигенам бледной трепонемы на очень ранней стадии заболевания. Наиболее значимыми в диагностике сифилиса являются антитела к антигенам бледной трепонемы TpN15, TpN17, TmpA и TpN47. Эти антигены - мембранные белки, имеющие молекулярную массу 15, 17, 44,5 и 47 кДа соответственно.

При внедрении в организм человека бледной трепонемы, противосифилитические антитела появляются в таком порядке: сначала развивается иммунный ответ к антигенам TpN17, затем к TpN47, после TpN15 и позже всех TmpA. При учете результатов теста оценивают реактивность сыворотки к каждому из них в отдельности. Например, когда в линейном блоте имеется реактивность только к антигенной линии TpN17 и TpN47, это означает, что болезнь в начальной стадии. Чем больше антигенных линий становятся реактивными, тем дальше развивается инфекция. При лечении сифилиса картина реактивности в этом тесте меняется.

Определение IgM к протеинам с молекулярной массой 15,17, 41, 47 кДа позволяют выявить 29,2% больных при вторичном сифилисе, 12,5% – при раннем скрытом сифилисе и 8,0% – при серорезистентности. Поиск IgG к тем же молекулам характеризуется чувствительностью 61,6% при серорезистентности и 100% при вторичном и раннем скрытом сифилисе.

6. Чувствительность и специфичность

Согласно данным литературы, чувствительность и специфичность теста очень высокие - 99,6-100 и 99,3-99,5 % соответственно. В классическом методе это достигается за счет электрофоретического разделения белков, глико- и липопротеинов и максимальной специфичности детектирующих иммунных сывороток или моноклональных антител. В оптимально отработанных условиях с помощью иммуноблоттинга можно обнаруживать антиген в количествах менее 1 нг в испытуемом объеме.

Чувствительность линейного блота также составляет 99.6%, а специфичность находится в диапазоне между 99.3% и 99.5%.

По оценке специалистов иммуноблоттинг с рекомбинантными высокоспецифичными антигенами по чувствительности и специфичности аналогичен РИФ-абс.

Согласно данным зарубежной литературы и результатам изучения в ЦНИКВИ, метод иммуноблоттинга обладает при диагностике сифилиса высокой чувствительностью (98,8-100%) и специфичностью (97,1-100%).

7. Область применения метода

Иммуноблотинг (иммуноблот) является высокоспецифичным и высокочувствительным референтным методом. Высокие чувствительность и специфичность позволяют рассматривать этот метод как подтверждающий тест на сифилис. Метод может применяться для подтверждения диагноза, а также в случае, если другие трепонемные тесты дают сомнительные и противоречивые результаты. С помощью иммуноблоттинга можно подтвердить диагноз у пациентов с положительными или неопределенными результатами анализов, полученных в том числе и при помощи РПГА или ИФА.

8. Источники и причины ошибок при постановке, ложноположительные и ложноотрицательные результаты

Ложноположительные результаты очень редки. Ложноотрицательные результаты бывают также достаточно редко и наблюдаются у больных с иммунодефицитами – чаще у ВИЧ- инфицированных и при эффекте диагностического «окна» из-за задержки синтеза антител, а также при ошибках на этапе постановки.

Использование современных тест-систем диктует точное соблюдение всех требований, предъявляемых как к материалу, так и к выполнению постановки реакции. В основном, источник ошибок - нарушение порядка и технологии проведения исследования (особенно для классического вестерн-блота), несоблюдение рекомендаций производителей тест-наборов. . Ошибки могут быть также допущены при сборе, доставке, хранении проб сыворотки крови, а также при выполнении тестов. Помимо испорченных образцов, среди других возможных причин - использование тест-наборов с истекшим сроком годности, а также ошибки при анализе результатов исследования.

9. Особенности, преимущества и недостатки

Уникальность иммуноблота заключается в его высокой информативности и достоверности результатов.

Тест не требует высокоочищенных антигенов, референтных и контрольных сывороток. Идентификация мишени антител основана на молекулярном весе белка, с которым реагируют антитела из сыворотки пациента. В одной реакции может быть обнаружено связывание антител с несколькими антигенами, каждый из которых может быть точно охарактеризован. За счет этого иммуноблоттинг обладает рядом преимуществ перед другими методами выявления антител, результаты которых зависят от стандартизации, чувствительности, качества субстрата, нестабильности или нерастворимости определенных антигенов

Метод легко воспроизводим, относительно прост в исполнении и интерпретации результатов, дает возможность определять спектр антител сразу к нескольким антигенам Т. pallidum и оценивать вклад в общую реакцию антител различной специфичности.

Применение высокоочищенных рекомбинантных и пептидных антигенов снижает до минимума неспецифическую реактивность сывороток. Использование метода дает возможность отказа от трудоемких и субъективных методов, представляющих опасность для исследователя (перевивка штаммов Г. pallidum, работа с патогенной Т. pallidum при постановке реакции). Это определяет предпочтение метода иммуноблоттинга перед другими трепонемными тестами (РИФ и в особенности РИБТ) для диагностики сифилиса.

10. Модификации метода

Существует несколько коммерческих тест-систем на основе данного метода. Одни из них выполнены в формате вестерн-блота , состоят из стрипов, на которые перенесены белковые компоненты T. pallidum, предварительно разделенные электрофорезом в полиакриламидном геле.

Другие выполнены в формате линейного блота , состоят из стрипов, на которых в виде дискретных линий сорбированы рекомбинантные и синтетические полипептиды - аналоги поверхностных антигенов T. pallidum, TpN15, TpN17, TpN47 и TmpA.

Результаты вестерн-блота труднее интерпретировать, так как на стрипах выявляется большое разнообразие антител, многие из которых являются группоспецифическими. Напротив, интерпретация результатов линейного блота не вызывает затруднений; кроме того, дополнительные контрольные линии, нанесенные на стрип, позволяют проводить полуколичественную оценку уровня антител к четырем антигенам T. pallidum.

xMAP-технология

хМАР - современная технология, позволяющая проводить многопараметрические исследования путем одновременной детекции множества аналитов в одном биологическом образце. В качестве твердой фазы используются окрашенные микросферы, покрытые захватывающими реагентами (олигонуклеотидами, антителами, антигенами).

Исследуемый образец добавляется к раствору, в котором содержатся микросферы. Выявляемые в образце аналиты связываются с соответствующей микросферой, после чего в раствор вносится детектирующий агент (детектирующие антитела, флюоресцентная метка). Для детекции определяемого аналита используется система двух лазеров, позволяющих проводить как качественную оценку наличия аналита в пробе (для этого используется красный лазер, классифицирующий микросферы по цвету), так и количественную оценку содержания аналита в пробе (для этого используется зеленый лазер).

Раздел:		Гинекология Урология Артрология Венерология Гастроэнтерология Генетика Гомеопатия Дерматология Иммунология и аллергии Инфекционные заболевания Кардиология Косметология Неврология Онкология Отоларингология Офтальмология Проктология Психиатрия Пульмонология Сексопатология Стоматология Терапия Травматология и ортопедия Хирургия Эндокринология Логопедия
Ключевые слова:
Искать		все слова:
		хотя бы одно слово:

Всего страниц: 3
Страницы: 01

Резюме. Последнее место работы: Федеральное государственное учреждение науки «Центральный научно исследовательский институт эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Институт комплексных проблем восстановления резервных возможностей человека. АКАДЕМИЯ СЕМЕЙНОЙ И РОДИТЕЛЬСКОЙ КУЛЬТУРЫ «МИР ДЕТЕЙ» В рамках национальной программы демографического развития России ШКОЛА БУДУЩИХ РОДИТЕЛЕЙ «ОБЩЕНИЕ ДО РОЖДЕНИЯ» Должность: Старший научный сотрудник. Врач акушер – гинеколог, инфекционист. Образование 1988-1995 Московский медицинский стоматологический институт им. Семашко, по специальности лечебное дело (диплом ЭВ№362251) 1995- 1997клиническая ординатура при ММСИ им. Семашко по специальности «акушерство и гинекология» с оценкой «отлично». 1995 « УЗИ диагностика в акушерстве и гинекологии» РМАПО. 2000 «Лазеры в клинической медицине» РМАПО. 2000 «Вирусные и бактериальные заболевания вне и во время беременности» НЦАГи П РАМН. 2001 «Заболевания молочных желез в практике акушера – гинеколога» НЦАГ и П РАМН. 2001 «Основы кольпоскопии. Патология шейки матки. Современные методы лечения доброкачественных заболеваний шейки матки» НЦАГ и П РАМН. 2002 «ВИЧ – инфекция и вирусные гепатиты» РМАПО. 2003 экзамены «кандидатский минимум» по специальности «акушерство и гинекология» и «инфекционные болезни».

Вопрос: Здравствуйте, в 2014 году сдала кср на сифилис (anti-Treponema pallidum Ig M - отр.;anti-Treponema pallidum суммарный Ig M+ Ig G пол. КП 11,2 Титр 1:640; РМП- положительный +++ Титр 1:8). Сдавала анализы в независимой лаборатории.С этими анализами пришла на прием к венерологу после проведения нескольких подтверждающих анализов был поставлен диагноз:"ранний скрытый сифилис", т.к. никаких внешних признаков болезни у меня не было и нет. Прошла стационарное лечение (пенициллин в/м 20 суток (кд 80 млн ед)данные анализов после выписки: рмп_3+ ;ифа IgM (+)КП=1,4.IgG(+) КП=5,5.рпга 4+ ;риф абс 3+;риф200 2+;вич гепатит -отр мазки на иппп -без паталогии. В настоящее время нахожусь на сероконтроле,т.к. последние анализы дали слабоположительный результат (сдавала эдс в декабре 2015) перед этим в течении полугода результаты были отрицательные и меня уже хотели снять с учета врач рекомендовала мне прийти на сдачу анализов через 6 месяцев:в июне. Желая узнать изменились ли мои анализы в лучшую сторону сдала в независимой лаборатории в апреле 2016 и вот результат:IgM отр.,суммарный IgM+IgG положит.КП = 24,939 Титр 1:1280, РМП положит. +++ Титр 1:32. Объясните пожалуйста почему такие плохие результаты. Они стали намного хуже,чем до лечения. Повторное заражение исключено:не имею половых контактов с момента обнаружения болезни.

Ответ врача: Здравствуйте! Вам надо обратиться к вашему лечащему врачу. Пересдать анализ в КВД.

Медицинские услуги в Москве:

Вопрос: Здравствуйте! Помогите расшифровать анализ КСР:anti-treponema pallidum IgM отрицательный,anti-treponema pallidum суммарный IgM+IgG положительный КП 11,2 Титр 1:640,siphilis ЭДС(РМП) положительный +++ Титр 1:8. Что это значит?

Ответ врача: Здравствуйте! Вы больны сифилисом, вам надо обратиться к дерматовенерологу.

Вопрос: Здравствуйте! Подскажите, пожалуйста, в 2010г. после сдачи крови, как донор, пришли слабоположительные результаты на специфические анализы сифилиса (РИФ, КСР). RW и МРП оставались стабильно отрицательными. У мужа все анализы отрицательные. Ранее не болела. Повторяли анализы 6 раз (с июля по ноябрь) - результаты анализов не менялись. Пролечилась в стационаре (21 день по 8 уколов пенициллина в сутки в/м).

2011 год - RW и МРП у меня и у мужа - отрицательные.

2012 год - я беременнею, RW и МРП - отрицательные. У мужа тоже. Профлечение не назначается. В декабре 2012 года - рожаю.

У ребенка в роддоме результаты обследования крови (МРП), узких специалистов, рентген - отрицательные.

Через 2 недели после родов сдаю у дерматолога анализы для снятия с учета - RW и МРП - отрицательные, РИФ, КСР - слабоположительные. Пересдача анализов в марте.

В возрасте 43 дней ребенком сдан анализ МРП - результат отрицательный. На спецефические анализы кровь не взяли, т. к. венку не смогли найти, отложили до марта.

КожВенДиспансер настаивает на профлечение ребенка, написали с мужем отказ от профлечения.

НЕ хочется колоть полуторамесячного младенца антибиотиками на "всякий случай".

Скажите, пожалуйста, чем обусловлены у меня такие результаты анализов?

Какова вероятность, что ребенок действительно болен?

Как часто придется сдавать кровь ребенку и до какого возраста?

Результаты каких анализов являются решающими для снятия с учета?

Когда сын пойдет в садик - будет ли медсестра осведомлена о моем диагнозе и подозрении на заболевание ребенка? О врачебной тайне речь даже не идет...

Как объяснить персоналу детской поликлиники, что у ребенка ВОЗМОЖНО есть врожденный сифилис и что кричать в коридоре, когда кругом очередь родителей с детьми: "А, это вы с сифилисом, проходите, сейчас анализ возьмем!" - как минимум не корректно (вот тебе и врачебная тайна!!!).

Как объяснить врачу в КВД, что здоровье ребенка - это, в первую очередь, НАША, РОДИТЕЛЬСКАЯ, забота и ответственность. Если при попытке обсудить ВОЗМОЖНОЕ течение болезни и ВОЗМОЖНОЕ лечение звучат фразы: "Вы врач? Какая вам разница, вы все равно не поймете! Вот вы отказываетесь его колоть, а он у вас и до трех лет не доживет, попомните мое слово. В интернете читали? Ну так может и лечить сами будете?"

Заранее спасибо за ответ.

Юлия

Ответ врача: Здравствуйте! Рекомендовать что либо в вашем случае сложно. Лечить ребенка нужно, только если анализы положительные, сдавать их нужно каждые 6 месяцев. Напишите жалобу главному врачу или в минздрав на врачей, которые не соблюдают врачебную тайну. Возмите диктофон и запишите все высказывания в ваш адрес. Можете воспользоваться помощью адвоката... Не сдавайтесь боритесь за свои права, хотя на Украине - это сложней, чем в России.

Вопрос: Здравствуйте! Беременность 23 недели. Подскажите, пожалуйста, нужно ли мне проходить профилактическое лечение, если при анализе на сифилис следующие результаты (трижды): КСР А1-, А2-, Микрореакция - отр, РГПА3+, РИф3+, ИФА М - не обнаружен, G 3. Лечение не проходила никогда, третья беременность. Один половой партнер (муж)12 лет. У него все анализы отрицательные. Спасибо

Ответ врача: Здравствуйте! Лечение проходить не надо. Необходимо наблюдение.

Вопрос: Я болела сифилисом 3года назад.Сейчас сдала анализы TPHA положительно 1:320,IgM отрицательно.,IgG 173.,RPR положительно.Надо ли ещё раз пролечиваться? Спасибо заранее за ответ

Ответ врача: Здравствуйте. Выявление IgG говорит о наличии иммунитета к данному заболеванию. О активности процесса говорит выявление IgM. Диагностика скрытого сифилиса: реакция микропреципитации (РМП) или ее аналог RPR/РПР в качественном и количественном вариантах (нетрепонемные тесты), и в случае положительного результата подтверждение в двух трепонемных тестах одновременно из перечисленных: РПГА, ИФА, РИФ, КСР, РИТ (до 2006 г.). «Люис RPR тест», «Люис РПГА тест», «АЙС Сифилис», «INNO LIA Syphilis Score». Вопрос о проведении лечения решается при очной консультации. Вам следует проконсультироваться с венерологом.

Всего страниц: 3
Страницы: 01

Диагностика сифилиса основывается на клинических и лабораторных данных. Среди последних чрезвычайно ценны серологические исследования, которые проводят не только для подтверждения диагноза сифилиса, но и для наблюдения за его динамикой под влиянием проводимой терапии.

Серология сифилиса сегодня представляет собой отдельную область знаний. Созданы различные реакции, получившие в разных странах государственное признание. Важно, чтобы полученные результаты были правильно истолкованы, чего можно достигнуть лишь при знании основ серологии.

В нашей стране для серологической диагностики сифилиса в соответствии с методическими рекомендациями Министерства здравоохранения применяют:

Микрореакцию преципитации (МР) с кардиолипиновым антигеном - отборочный тест при обследовании населения на сифилис;

Реагиновый плазменный тест (RPR) также, будучи не трепонемным, используется в качестве скринингового теста;

Комплекс серологических реакций (КСР), в который входят реакция связывания комплемента (РСК) с трепонемным и кардиолипиновым антигенами и МР;

Реакция иммобилизации бледных трепонем (РИБТ), в которой в качестве антигена используют патогенные бледные трепонемы штамма Никольса;

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) (в модификациях:РИФ-абс, РИФ-ц и РИФ с капиллярной кровью из пальца); в качестве антигена в РИФ используется патогенная бледная трепонема штамма Никольса;

Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) с антигеном из культуральных или патогенных бледных трепонем;

Иммуноферментный анализ (ИФА) с антигеном из культуральных или патогенных бледных трепонем.

Все указанные реакции имеют разную чувствительность и специфичность и рекомендованы к применению в зависимости от поставленной задачи.

При массовых профилактических обследованиях населения на сифилис применяют МР с плазмой крови или инактивированной сывороткой крови обследуемых. Результаты реакции оценивают-

ся качественно как 4+, 3+, 2+ и отрицательные. Преимущество экспресс-метода заключается в быстроте получения ответа (через 30-40 мин), небольшом объеме необходимой для анализа крови (2-3 капли), которую можно брать у пациентов из пальца.

С помощью этого экспресс-метода обследуют лиц, подлежащих периодическим медицинским осмотрам на венерические болезни, больных соматических стационаров, лиц, помещенных в спецприемники. Если экспресс-метод применяется изолированно, то является лишь отборочным тестом. На основании его положительного результата диагноз сифилиса не ставят, а обследуемых направляют к дерматовенерологу для дальнейшего клинического обследования и исследования их крови с помощью любого из других диагностических тестов (КСР, РИБТ, РПГА, ИФА или РИФ). Экспресс-метод не применяют у беременных, доноров в связи с тем, что он часто дает ложноположительные результаты. Средние медицинские работники, прошедшие специальную подготовку, производят взятие крови из пальца и постановку МР. Учитывать ее результаты обязаны врачи-лаборанты.

РСК с трепонемным и кардиолипиновым антигенами применяются для подтверждения диагноза сифилиса при наличии активных проявлений болезни, для обследования лиц, бывших в половом контакте с больным сифилисом, выявления латентного (скрытого) сифилиса, эффективности проводимой терапии, при обследовании больных психиатрических и неврологических стационаров, доноров и беременных, включая лиц, направляемых на искусственное прерывание беременности.

Кровь для исследования берут в количестве 5-7 мл из локтевой вены стерильной иглой при соблюдении правил асептики. У грудных детей кровь можно получить из височной вены или из надрезов на пятке. Кровь берут строго натощак (спустя 5-6 ч после приема пищи) и оставляют ее в чистых сухих пробирках на 2-3 ч при комнатной температуре для свертывания. Постановку КСР и специфических реакций производят в серологических лабораториях кожно-венерологических учреждений, а в сельской местности - в лабораториях сельских районных больниц.

Для пересылки крови для исследования в отдаленные лаборатории очень удобен метод сухой капли. Для этого на следующий день после забора крови сыворотку отделяют от сгустка. Градуированной пипеткой набирают 1 мл сыворотки и выливают ее в виде двух отдельных кружков на полоску плотной бумаги (вощаной или целлофана) размером приблизительно 6x8 см. На свободном крае бумаги надписывают фамилию, имя и отчество больного, дату забора крови и порядковый номер. Сыворотку на бумаге, защищенную от прямых лучей солнца и пыли, оставляют

на 24 ч при комнатной температуре для засыхания. После этого полоски бумаги с высушенной сывороткой свертывают и отсылают в лабораторию.

РСК в КСР с кардиолипиновым антигеном не очень чувствительна и становится положительной через 2-4 нед после возникновения твердого шанкра, причем титр реагинов постепенно нарастает и достигает максимума (1:160-1:320 и выше) при вторичном свежем сифилисе. Затем титр реагинов постепенно падает и при вторичном рецидивном сифилисе обычно не превышает 1:80-1:20. У больных с третичным сифилисом указанные реакции дают положительный результат только в 70% случаев.

Следует подчеркнуть, что КСР не является строго специфичным для сифилиса и в ряде случаев может давать ложноположительные (неспецифические) результаты. Такие ложноположительные реакции наблюдаются у больных лепрой, малярией, иногда с аутоиммунным заболеванием, новообразованиями, пневмонией, туберкулезом, заболеваниями печени, при приеме лекарственных препаратов (сульфаниламиды, глюкозиды, валериана и др.), а также во время беременности, при менструациях и т.д. При взятии крови для исследования на КСР необходимо предупреждать обследуемого, чтобы он за 2-3 дня до этого не употреблял алкоголь, жирную пищу, не принимал лекарственные препараты. Не рекомендуется исследовать кровь в течение 1-й недели после вакцинации, травм, хирургических вмешательств, при лихорадочных состояниях, в течение первых 2 нед после родов, у новорожденных в первые 10 дней жизни, поскольку физико-химические изменения в сыворотке крови при этих состояниях могут быть сходны с теми, которые наблюдаются у больных сифилисом.

Ложноположительные результаты могут получаться также в связи с техническими ошибками (неполный гемолиз, нестерильное взятие крови, недостаточная квалификация лаборантов).

Для отдифференцирования ложноположительных результатов КСР от истинных, для диагностики скрытых и поздних форм сифилиса, при подозрении на сифилитическую инфекцию, для установления ретроспективного диагноза заболевания рекомендуется применять специфические серологические реакции (РИБТ, РПГА, ИФА или РИФ)

Для проведения специфических серологических реакций кровь в количестве 5-10 мл берут также из локтевой вены натощак. Кровь вливают в сухую пробирку для исследования на РИФ и в стерильную пробирку для исследования на РИБТ. Постановка специфических серологических реакций на сифилис производится в специализированных лабораториях кожно-венерологических учреждений.

РИФ основана на непрямом методе определения флюоресцирующих антител. Антигеном в этой реакции служит взвесь убитых культуральных бледных трепонем, фиксированная к предметным стеклам, на которые наносят исследуемую и антивидовую флюоресцирующую сыворотки. Результаты РИФ определяют под люминесцентным микроскопом путем оценки свечения трепонем в препарате. При положительном результате трепонемы имеют желтовато-зеленое свечение, степень которого обозначают плюсами от 1 до 4; при отрицательных результатах трепонемы не светятся.

Другая специфическая реакция на сифилис - РИБТ - основана на феномене обездвиживания бледных трепонем антигенами сыворотки крови больного в присутствии комплемента. В качестве антигена для РИБТ используют взвесь живых бледных трепонем, полученных от зараженных сифилисом кроликов. Подсчет утративших подвижность (иммобилизированных) трепонем ведут под микроскопом. Результаты реакции оценивают в процентах: от 0 до 20% - отрицательная, от 21 до 30% - сомнительная, от 31 до 50% - слабоположительная, от 51 до 100% - положительная. РИБТ становится положительной в конце первичного периода сифилиса и остается таковой в течение всех периодов этого заболевания, а иногда и после полноценного противосифилитического лечения. При третичном сифилисе, специфических поражениях внутренних органов, нервной системы, при врожденном сифилисе, когда КСР часто отрицателен, РИБТ дает положительные результаты в 98-100% случаев. Диагноз скрытого сифилиса обязательно следует подтвердить положительной РИБТ.

РИБТ также может давать ложноположительные результаты, если в исследуемой сыворотке содержатся трепонемоцидные вещества (антибиотики - пенициллин, тетрациклин), вызывающие неспецифическую (токсическую) иммобилизацию бледных трепонем. Поэтому нельзя исследовать кровь на эту реакцию раньше, чем через 2 нед после окончания приема антибиотиков.

Серологические исследования можно использовать и для определения поражения сифилисом нервной системы, исследуя цереброспинальную (спинно-мозговую) жидкость больного. Ее исследуют также на наличие белка, ферментных элементов, которые свидетельствуют о патологии и помогают диагностировать ту или иную форму нейросифилиса. Цереброспинальную жидкость получают при люмбальной пункции. Проведенная асептически, она не представляет никакой опасности и может быть осуществлена врачом даже в амбулаторных условиях. Серологические исследования цереброспинальной жидкости показаны во всех случаях сифилиса

Анализ на сифилис является одним из самых распространенных среди лабораторных исследований. Широко используются анализы на сифилис при проведении профилактических обследований. При помощи микроскопии выявляется возбудитель сифилиса — . При помощи серологических реакций подтверждается диагноз сифилиса, устанавливается диагноз скрытого сифилиса, проводится контроль эффективности лечения, определяется излеченность больных.

Диагноз сифилиса устанавливается на основании клинических данных, обнаружении возбудителей сифилиса в образцах материала и подтверждении диагноза серологическими методами исследования. Проявления сифилиса многочисленны и многообразны, ввиду чего болезнь выявляется врачами разных специальностей. Дифференциальная диагностика первичного сифилиса проводится с целым рядом заболеваний.

Рис. 1. На фото первичное проявление сифилиса — твердый шанкр.

Антитела к бледной трепонеме и серологическая диагностика

При заражении сифилисом в организме больного образуются антитела. Серологическая диагностика помогает врачу изучать динамику образования антител в организме больного сифилисом в начальных стадиях заболевания, в период лечения и после его окончания, решить вопрос рецидив заболевания у больного или повторное заражение (реинфекция), поставить диагноз сифилиса при массовых медицинских условиях.

Антитела к бледной трепонеме IgM

Первыми после заражения начинают вырабатываться антитела IgM. Они начинают выявляться при помощи серологических реакций уже со второй недели после заражения. На 6 — 9 неделях заболевания их количество становится максимальным. Если больной не лечился, то антитела исчезают через полгода. Антитела IgM исчезают через 1 — 2 мес. после , через 3 — 6 мес. — после лечения позднего сифилиса. Если регистрируется их рост, то это служит или говорит о повторном заражении. Молекулы IgM крупные и через плаценту к плоду не переходят.

Антитела к бледной трепонеме IgG

Антитела иммуноглобулины IgG появляются в конце первого месяца (на 4-й неделе) от момента заражения. Их титр выше, чем титр IgM. IgG сохраняются после излечения достаточно длительное время.

Неспецифические антитела

Существует множество серологических реакций. Это объясняется антигенной множественностью бледных трепонем. В сыворотке крови больного человека на разных стадиях сифилиса кроме специфических образуются те или иные неспецифические антитела — агглютинины, комплементсвязывающие, иммобилизины, антитела, вызывающие иммунную флюоресценцию, преципитины и др. Серологические реакции по выявлению неспецифических антител обладают относительной специфичностью поэтому, чтобы избежать диагностических ошибок, следует пользоваться не одним, а комплексом серологических реакций (КСР).

Ложноположительные анализы на сифилис

Отличительной особенностью нетрепонемных тестов является получение ложноположительных реакций. Антитела-реагины, которые вырабатываются в крови человека против кардиолипинового антигена, регистрируются не только при сифилисе, но и при других заболеваниях: коллагенозах, гепатитах, заболеваниях почек, тиреотоксикозе, онкозаболеваниях, при инфекционных заболеваниях (лепра, туберкулез, бруцеллез, малярия, сыпной тиф, скарлатина), при беременности и месячных циклах, при приеме жирной пищи и алкоголя. Отмечено, что с возрастом количество ложноположительных реакций возрастает.

Рис. 2. На фото первичный сифилис у женщин.

Лабораторная диагностика сифилиса с применением серологических реакций

Серологические тесты на сифилис подразделяются на трепонемные и нетрепонемные.

1. Нетрепонемные тесты

В качестве антигена в этой группе тестов используется кардиолипиновый антиген. Липидные антигены возбудителей сифилиса самые многочисленные. Они составляют 1/3 сухой массы клетки. С помощью нетрепонемных тестов выявляются антитела-реагины, которые вырабатываются против кардиолипинового антигена. В эту группу входит реакция связывания комплемента (РСКкард), реакция микропреципитации (РМП), реакция быстрого определения реагинов плазмы (RPR) и др. С помощью нетрепонемных тестов проводится первичный скрининг на сифилис (обследование групп населения), а возможность получения результатов в количественном варианте позволяет использовать эти тесты с целью контроля эффективности лечения. Положительные результаты нетрепонемных тестов должны подтверждаться трепонемными тестами. Отличительной особенностью нетрепонемных тестов является получение ложноположительных реакций.

2. Трепонемные тесты

В трепонемных тестах используются антигены трепонемного происхождения, выделенные из культуры бледных трепонем. С их помощью подтверждаются положительные результаты нетрепонемных тестов. В группу входят: РСКтреп — реакция связывания комплемента, РИФ — реакция иммунофлюоресценции и ее модификации, РИТ, РИБТ — реакция иммобилизации бледных трепонем, РПГА — реакция пассивной гемагглютинации, ИФА — иммуноферментный анализ.

3. Тесты на сифилис с использованием рекомбинантных антигенов

Антигены для данной группы тестов получают генно-инженерным путем и используют в реакциях — РПГА и ИФА, в анализах иммуноблоттинга (ИБ) и иммунохроматографическом анализе.

Рис. 3. Для диагностики сифилиса используется комплекс серологических тестов.

Диагностика сифилиса с применением нетрепонемных тестов

Для выявления сифилиса используются нетрепонемные тесты или комплекс серологических реакций (КСР). Серологическая диагностика применятся с 5-й недели от момента заражения или с 2-3 недели после появления . Антитела выявляются практически у всех больных со свежим первичным, . Серологические реакции положительные у 70 — 80% больных с , в 50 — 60% случаев у больных третичным скрытым сифилисом.

Серологические реакции с применением нетрепонемных тестов могут давать ложноположительные результаты.

Рис. 4. Забор крови для проведения анализа на сифилис.

Реакция связывания комплемента (РСК кард, КСК с КА, реакция Вассермана)

Реакция Вассермана (RW, РВ), изобретенная А. Вассерманом более 100 лет назад, сегодня претерпела множество изменений, однако, как дань традиции, сохранила свое название по настоящее время. Реакция связывания комплемента с применением кардиолипинового антигена предназначена не только для выявления антител, но и выполняется в количественном варианте — с разными разведениями сыворотки, что позволяет использовать ее для контроля эффективности лечения. Низкая чувствительность и специфичность, получение ложноположительных результатов — отрицательные стороны данного вида исследования.

Суть реакции Вассермана заключается в следующем: антигены, которые применяются при постановке реакции Вассермана, в случае наличия антител к возбудителям сифилиса в крови человека посредством комплимента связываются с ними и выпадают в осадок. Интенсивность реакции обозначают знаком (+). Реакция может быть отрицательной (-) — отсутствие осадка, сомнительной (небольшой осадок или +), слабоположительной (++), положительной (+++) и резко положительной (++++).

Более чувствительной является видоизмененная реакция Вассермана — реакция Колмера. С ее помощью выявляются антитела в сыворотках, где реакция Вассермана дала отрицательный результат.

При резко положительных реакциях проводится количественное определение реагинов, для чего используется сыворотка в разведениях от 1:10 до 1: 320, что позволяет использовать данный вид исследования для контроля эффективности лечения. Например, снижение титра антител и последующая их серонегативация (получение отрицательных результатов), говорит об успешном излечении заболевания.

Рис. 5. Анализ крови на сифилис — реакция Вассермана.

Микрореакция преципитации (МРП)

Микрореакция преципитации применяется для массовых обследований отдельных групп населения, диагностики сифилиса и контроля над эффективностью лечения. Для проведения данного вида исследования необходимо небольшого количества исследуемого материала. В основе микрореакции преципитации лежит иммунологическая реакция антиген-антитело. В случае наличия антител в сыворотке крови обследуемого комплекс антиген-антитело выпадает в осадок с образованием хлопьев. Реакция проводится в лунках специальной стеклянной пластины. Оценивается по интенсивности выпавшего осадка и величине хлопьев в (+) как реакция Вассермана. При обследовании беременных, доноров и для контроля эффективности лечения не применяется. VDRL и RPR являются разновидностями микрореакций.

Рис. 6. Вид реакции преципитации в капле на стекле.

Рис. 7. Анализ крови на сифилис — реакция микропреципитации.

Рис. 8. Набор для проведения реакции быстрого определения реагинов плазмы (Тест на сифилис RPR).

Все положительные тесты, полученные при проведении неспецифических серологических реакций, требуют подтверждения специфическими реакциями — трепонемными тестами.

Диагностика сифилиса с применением трепонемных тестов

При проведении трепонемных тестов используются антигены трепонемного происхождения. Их отрицательной стороной является невозможность использования для контроля эффективности проводимого лечения, получение положительных результатов при спирохетозах и невенерических трепонематозах и получение ложноположительных результатов при онкологических заболеваниях, лепре, некоторой эндокринной патологии. Такие тесты, как РПГА, ИФА и РИФ остаются положительными многие годы после излечения сифилиса, а в некоторых случаях и пожизненно.

РИБТ и РИФ являются более специфическими из всех серологических реакций, применяемых для диагностики сифилиса. Они позволяют различать ложноположительные реакции, выявлять поздние формы сифилиса, протекающие с отрицательными реакциями. При помощи РИБТ распознаются ложноположительные реакции у беременных, когда необходимо решить вопрос об инфицированности ребенка.

Реакция иммобилизации бледных трепонем (РИБТ, РИТ)

Суть реакции заключается в том, что антитела, находящиеся в сыворотке крови больного, обездвиживают бледные трепонемы. Отрицательной считается реакция при иммобилизации до 20% возбудителей, слабоположительная — 21 — 50%, положительная — 50 — 100%. РИБТ иногда дает ложноположительные результаты. Тест сложный и трудоемкий, однако, является незаменимым при проведении дифференциальной диагностики скрытых форм заболевания и ложноположительных результатов серологических реакций, в том числе у беременных. РИБТ дает 100% положительный результат при вторичном, раннем и позднем сифилисе, в 94 — 100% случаев — при других формах сифилиса.

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)

Суть реакции заключается в том, что бледные трепонемы (антигены), соединенные с антителами, меченными флюорохромами, издают в люминесцентном микроскопе желто-зеленое свечение. Результат оценивается знаком (+). С помощью РИФ выявляются иммуноглобулины класса А. Реакция иммунофлюоресценции становится положительной раньше, чем реакция Вассермана. Она всегда положительная при вторичном и латентном сифилисе, в 95 — 100% случаев положительная при третичном и врожденном сифилисе. Техника проведения данного вида исследования проще, чем у РИБТ, но заменить РИФ на РИБТ невозможно, так данная реакция уступает РИБТ по специфичности. РИФ-10 (модификация РИФ) более чувствительна, РИФ-200 и РИФ-абс более специфичны.

Рис. 9. Анализ крови на сифилис — реакция иммунофлюоресценции (РИФ).

Реакция иммунного прилипания бледных трепонем (РИПБТ)

Суть реакции заключается в том, что сенсибилизированные сывороткой больного бледные трепонемы в присутствии комплемента прилипают к поверхности эритроцитов. Полученные комплексы при цетрофугировании выпадают в осадок. Чувствительность данного теста и специфичность близки к РИФ и РИБТ.

Иммуноферментный анализ на сифилис (ИФА)

С помощью ИФА определяются иммуноглобулины класса М и G. Методика IgM – ИФА может быть использована в качестве скринингового и подтверждающего теста. Чувствительность ИФА и его специфичность аналогичны РИФ. При сифилисе ИФА дает положительные результаты с третьего месяца инфицирования и довольно долго (иногда всю жизнь) остается положительным.

Рис. 10. Иммуноферментный анализатор.

Реакция пассивной (непрямой) гемагглютинации (РПГА)

РПГА основана на способности эритроцитов, на которых адсорбированы антигены бледной трепонемы, в присутствии сыворотки больного склеиваться (гемагглютинация). РПГА применяется для диагностики всех форм сифилиса, в том числе скрытого. При применении высокого качества антигена данный вид серологической реакции превышает все остальные тесты по специфичности и чувствительности.

Рис. 11. РПГА применяется для диагностики всех форм сифилиса.

Рис. 12. Анализ на сифилис — реакция пассивной (непрямой) гемагглютинации (схема).

Рис. 13. Вид перевернутого зонтика, занимающего все дно пробирки, свидетельствует о положительной реакции. В случае, когда эритроциты оседают столбиком («пуговка») в центре дна пробирки говорят об отрицательной реакции.

Рис. 14. Тест РПГА в лабораторных условиях.

Микробиологическая диагностика

Наряду с серологической диагностикой методика обнаружения бледных трепонем (микробиологическая диагностика) играет важную роль, особенно в период серонегативного сифилиса, когда еще в крови отсутствуют антитела, но уже есть первые проявления свежего первичного сифилиса (твердый шанкр).

Биологическим материалом для исследования служит отделяемое с поверхности твердых язв (шанкров), содержимое пустулезных сифилидов, мокнущих и эрозивных папул, пунктаты инфицированных лимфатических узлов, ликвор и амниотическая жидкость, для проведения ПЦР — кровь.

Наилучшей методикой обнаружения возбудителей сифилиса является исследование биологического материала в темном поле микроскопа. Данная методика позволяет увидеть бледные трепонемы в живом состоянии изучить ее особенности строения и движения, отличить патогенные возбудители от сапрофитов.

Рис. 15. Анализ на сифилис — темнопольная микроскопия.

Рис. 16. При изучении сухих мазков используется окраска по Романовскому-Гимзе. Бледные трепонемы окрашиваются при этом в розовый цвет, все остальные виды спирохет — в фиолетовый.

Обнаружение бледных трепонем при микроскопии в темном поле — абсолютный критерий окончательной диагностики сифилиса.

Рис. 17. Для выявления бактерий применяется реакция иммунофлюоресценции (РИФ) — трепонемный тест. Специфический комплекс антиген- антитело при соединении со специфической сывороткой, меченной флюорохромом, в свете люминесцентного микроскопа дает свечение бактерий зеленоватым цветом.

Рис. 18. Возбудители сифилиса хорошо просматриваются в мазках, приготовленных по методике Левадити (импрегнация серебром). Бледные трепонемы темного цвета на фоне желтой окраски клеток инфицированных тканей.

Рис. 19. Возбудитель сифилиса при многократном увеличении.

Рис. 20. На фото колонии бледных трепонем. Получить культуру бактерий тяжело. Они практически не растут на искусственных питательных средах. На средах, содержащих лошадиную и кроличью сыворотки, колонии появляются на 3 — 9 сутки.

ПЦР на сифилис

Эффективным и перспективным сегодня является методика проведения полимеразной цепной реакции. ПЦР на сифилис позволяет получить результат в течение нескольких часов, а в собранном для диагностики материале может присутствовать хотя бы несколько возбудителей заболевания.

Рис. 21. ПЦР на сифилис позволяет обнаружить ДНК или ее фрагменты бледных трепонем.

Чувствительность данного метода исследования зависит от наличия в биологическом материале бледных трепонем и достигает 98,6%. Специфичность данного теста во многом зависит от правильного выбора мишени для амплификации при проведении диагностики и достигает 100%.

Вместе с тем, в связи с недостаточно изученной сравнительной характеристики чувствительности и специфичности прямых методов диагностики сифилиса и ПЦР, данный метод обследования в РФ для диагностики заболевания пока не разрешен.

ПЦР на сифилис разрешено проводить лишь в некоторых случаях, как дополнительный метод диагностики врожденного сифилиса, нейросифилиса, при затруднениях проведения диагностики сифилиса с использованием серологических методов исследования у ВИЧ-больных.

Серодиагностика применяется для подтверждения клинического диагноза сифилиса, постановки диагноза скрытого сифилиса, контроля за эффективностью лече ния, как один из критериев излеченности больных сифи лисом, для профилактики сифилиса (обследование опре деленных групп населения). Серологические реакции позволяют выявлять иммунные сдвиги в организме боль ного в ответ на размножение в нем возбудителя болезни.

Антигенное строение бледной трепонемы. Наиболее изучены следующие антигены:

1) протеиновые антигены бледной трепонемы; имеют в своем составе фракцию, общую для патогенных трепонем и сапрофитных трепонем, против которой синтезируются групповые антитела; кроме того, имеется фракция, специфичная только для пато генных трепонем; протеиновые антигены бледной трепонемы высокоиммуногенны, антитела против них появляются в организме в конце инкубацион ного периода или в течение первой недели после по явления твердого шанкра;

2) антигены полисахаридной природы; мало иммуно генны, так как антитела против них не достигают значительных титров, поэтому роль этих антител в серодиагностике сифилиса незначительна;

3) липидные антигены бледной трепонемы; составля ют около 30% сухой массы клетки; помимо липидов бледной трепонемы, в организме больного появля ется большое количество веществ липидной приро ды в результате разрушения клеток тканей, в основ ном, липидов митохондриальных мембран; по видимому, они имеют такое же строение, как и липидные антигены бледной трепонемы и обладают свойствами аутоантигенов; антитела в организ ме больного появляются примерно на 5–6 й неделе после заражения.

В иммунном ответе организма принимают участие как клеточные (макрофаги, Т лимфоциты), так и гумораль ные механизмы (синтез специфических иммуноглобули нов). Появление противосифилитических антител про исходит в соответствии с общими закономерностями иммунного ответа: вначале вырабатываются IgM, по мере развития болезни начинает преобладать синтез IgG; IgA вырабатываются в сравнительно небольших количествах.

Вопрос о синтезе IgE и IgD в настоящее время изучен недостаточно. IgM появляются на 2–4 й неделе после за ражения и исчезают у нелеченных больных примерно че рез 18 мес; при лечении раннего сифилиса - через 3–6 мес, позднего - через 1 год. IgG появляются обычно на 4 й не деле после заражения и достигают, как правило, более вы соких титров, чем IgM. Антитела этого класса могут дли тельно сохраняться даже после клинического излечения больного.

Сифилитические антитела могут быть неспецифическими (реагины) и специфическими (противотрепонем ными). Реагины направлены против липидных антигенов бледной трепонемы и против аутоантигенов, возникаю щих вследствие деструкции клеток организма. Следует иметь в виду, что реагины обнаруживаются также в нор мальных тканях, и их количество повышается при раз личных физиологических и патологических состояниях. Эти реагины могут быть причиной так называемых био логических ложноположительных серологических реак ций на сифилис.

Специфические антитрепонемные антитела, относящиеся к IgM и IgG, направлены против бледной трепоне мы и так же как и антигены трепонемы могут быть груп поспецифичными и видоспецифичными.

Для определения антител в сыворотке крови больного используют различные серологические реакции, отли чающиеся друг от друга чувствительностью, специфич ностью, сложностью постановки и стоимостью. Учиты вая, что все серологические реакции на сифилис в опреде ленных условиях могут быть ложноположительными, их следует ставить в комплексе и, при необходимости, в ди намике.

Серологические реакции, в зависимости от выявляемых ими антител, подразделяются на три группы:

I. Липидные (реагиновые) реакции:

1) микрореакции на стекле с липидными антигенами - экспресс метод диагностики (микрореакции преципитации - МРП, VDRL, CMF, RPR и др.);

2) реакция связывания комплемента (РСК) с липидными антигенами - реакция Вассермана;

3) осадочные реакции (реакция преципитации Кана, цитохолевая реакция Закса - Витебского и др.).

II. Групповые трепонемные реакции:

1) РСК с протеиновым антигеном Рейтера;

2) реакция иммунофлюоресценции (РИФ);

3) реакция иммунного прилипания (РИП).

III. Видоспецифичные протеиновые трепонемные реакции:

1) реакция иммобилизации бледных трепонем (РИТ);

2) РИФ Абс.и ее варианты (IgM FTA ABS, 19S IgM FTA ABS, и др.);

3) реакция непрямой гемагглютинации бледных трепонем (РПГА).

Различные серологические реакции используются для разных практических целей. За рубежом при массовых обследованиях населения и при необходимости экстренного выявления сифилиса используются отборочные ре акции (VDRL и др.). Для диагностики (подтверждения) сифилиса применяют РСК с кардиолипиновым и трепо немным антигенами и РИФ Абс. С целью контроля за эф фективностью терапии рекомендуют VDRL в количест венном исполнении, 19S IgM FTA ABS, и в качестве реакции экспертизы в случаях расхождения трепонем ных реакций применяют РИТ. При отрицательных ре зультатах РИТ и 19S IgM FTA ABS считается, что об следуемый не страдает сифилисом.

В отечественной практике используют комплекс серологических реакций, включающий:

1) отборочные реакции микропреципитации (МРП)с кардиолипиновым антигеном;

2) стандартные серологические реакции - РСК с кардиолипиновым и трепонемным антигенами;

3) РИФ и ее модификацию РИФ Абс.;

Отборочные серологические реакции на сифилис или микрореакции на стекле для экспресс?диаг? ностики

Эти реакции используются для массовых серологических обследований на сифилис (лиц декретированных профессий, больных соматических стационаров, пациен тов поликлиник и амбулаторий); для экспресс диагности ки в кожно венерологических диспансерах. Их не приме няют для обследования беременных и доноров, а также для контроля после излечения больных сифилисом.

Микрореакции можно ставить в обычных клинических лабораториях.

Постановка микрореакций осуществляется на стекле с каплей крови, плазмы, активированной или неактивиро ванной сывороткой и специальным кардиолипиновым антигеном. Кардиолипиновый антиген отличается высо кой чувствительностью и представляет собой экстракт

Бычьего сердца, обогащенный холестерином и лецити ном. МРП можно проводить по количественной методике с разведением сыворотки крови. Существует несколько вариантов микрореакций (VDRL, RPR, USR, ART), отли чающихся друг от друга в основном применяемым анти геном. В нашей стране используют микрореакции преци питации (МРП).

Преимуществом экспресс метода являются быстрота получения ответа (через 30–40 мин), небольшой объем необходимой для анализа крови (2–3 капли плазмы или сыворотки). МРП могут давать ложноположительные, а в отдельных случаях и отрицательные результаты при ак тивных формах сифилиса, поэтому окончательный диаг ноз этим методом устанавливать запрещено. У больных вторичным сифилисом (в 1% случаев) микрореакции, в частности, VDRL, могут быть отрицательными при по становке с цельной сывороткой и положительными при ее разведении (феномен прозоны, «prozoon phenome non»).

В качестве отборочных реакций рекомендуют также применять реакцию пассивной гемагглютинации (РПГА). Наивысшую чувствительность этого теста отмечают у не леченных (100%) и леченных (99,6%) больных как с ран ними, так и поздними формами сифилиса. При контроле результатов лечения тест не имеет значения, так как дает отрицательные результаты в малом количестве случаев. Возможность использовать антиген Рейтера, простота, высокая чувствительность, малая стоимость ставят РПГА на первое место среди методов для диагностики сифили са. Ценность ее еще более повышается при автоматиче ском выполнении.

Диагностические подтверждающие серологические реакции при сифилисе

Стандартные серологические реакции.

Реакция Вассермана (РВ). Разработана А. Вассерманом совместно с А. Нейссером и Бруком в 1906 г. Исторически это первый серологический метод диагностики си филиса. Реакция основана на феномене связывания комплемента (реакция Борде - Жангу) и определяет противолипидные антитела (реагины) - классическая реакция. В настоящее время реакцию связывания ком плимента ставят еще со специфическими трепонемными антигенами (неклассическая реакция).

Липидные антигены, используемые в РВ, являются неполноценными антигенами - гаптенами. Они не обла дают иммунногенной способностью. После специальной обработки эти гаптены приобретают свойства полноцен ных антигенов. Антигены, приготовленные из культу ральных и патогенных трепонем, представляют собой полноценные антигены.

В РВ используют одновременно два антигена: кардиолипиновый и трепонемный. Трепонемный антиген пред ставляет собой обработанную ультразвуком взвесь апато генных культуральных трепонем. Эти антигены образуют совместно с реагинами сыворотки крови больного им мунный комплекс, способный адсорбировать, связывать комплемент. Поскольку образовавшийся комплекс (реа гины + антиген + комплемент) невидим, для определения наступившего связывания комплемента необходима как индикатор гемолитическая система (смесь эритроцитов барана с гемолитической сывороткой).

Если комплемент связан в первой фазе реакции (реагины + антиген + комплемент), то гемолиз не наступит, эритроциты выпадут в осадок, легко заметный невоору женным глазом (РВ положительная).

Если в первой фазе комплемент связан не будет вследствие отсутствия в испытуемой сыворотке реагинов, то он используется гемолитической системой и произойдет ге молиз (РВ отрицательная). Степень выраженности гемо лиза в реакции Вассермана оценивается плюсами: полное отсутствие гемолиза 4+ (РВ резко положительная), едва начавшийся гемолиз 3+ (РВ положительная), значительный гемолиз 2+ (РВ слабоположительная), полный гемо

Лиз - РВ отрицательная.

Кроме качественной оценки РВ, имеется количественная постановка ее с различными разведениямии сыворот ки крови (1: 10, 1: 20, 1: 80, 1: 160, 1: 320). Титр реагинов определяется максимальным разведением, еще дающим резко положительный (4+) результат. Количественная постановка РВ имеет значение в диагностике некоторых форм сифилиса и при контроле за успешностью терапии.

Реакция Вассермана обладает недостаточной чувствительностью. Она отрицательна в начале первичной стадии, бывает негативной у 1/больных третичным активным сифилисом с поражениями кожи, слизистых оболочек, кос тей, внутренних органов, центральной нервной системы, поздним врожденным сифилисом, особенно если больные в прошлом подвергались лечению антибиотиками.

В первичном периоде сифилиса РВ становится положительной через 2–3 нед после появления твердого шан кра или на 5–6 й неделе после заражения, во вторичном - почти у 100% больных, в третичном активном - 70–75%, при спинной сухотке - у 50%, прогрессивном параличе - 95–98%.

После окончания специфического лечения первичного серопозитивного и вторичного свежего сифилиса реак ция становится отрицательной в сроки от 1,5 до 7–8 мес. При поздних формах сифилиса она может на долгие годы оставаться положительной несмотря на дополнительное лечение (серорезистентность). Для увеличения чувстви тельности РВ ставят на холоду.

Осадочные реакции (Кана, Закс - Витебского, Мейника) за рубежом в течение длительного ввремени явля лись основными для диагностики сифилиса. В нашей стране они обязательно дополняли РВ. Иммунологиче ская сущность осадочных реакций ничем не отличается от РВ, но для них готовят более концентрированные ан тигены, которые при взаимодействии с реагинами дают видимый глазом осадок, оцениваемый качественно. В на

Стоящее время эти реакции не используются.

Все реагиновые серологические реакции не являются строго специфичными и могут давать ложноположитель ные результаты.

Ложноположительные серологические реакции на сифилис. Ложноположительными (неспецифическими, биологически ложноположительными) называются по ложительные серологические реакции на сифилис у лю дей, которые никогда не болели и в момент обследования не болеют сифилисом.

В случаях ложноположительных серологических реакций в сыворотке крови обследуемых людей имеются только реагины, но отсутствуют иммобилизины, компле ментсвязывающие протеиновые антитела и антитела, оп ределяемые в РИФ.

Н. М. Овчинников (1987) выделяет три группы основных причин ложноположительных реагиновых серологических реакций на сифилис:

1) инфекционные заболевания, возбудители которых имеют антигенное сходство с бледной трепонемой (возвратный тиф, фрамбезия, беджель, пинта, леп тостероз; воспалительные процессы, обусловлен ные трепонемами, сапрофитирующими в полости рта и на половых органах);

2) физиологические и патологические состояния, приводящие к изменению обмена веществ, особен но липидного (беременность, подагра, сыпной тиф, малярия, пневмония, лепра, эндокардит, диффуз ные болезни соединительной ткани, инфаркт мио карда, сотрясение мозга, искусственная иммуниза ция, онкологические заболевания; отравление свинцом, фосфором, хлороформом; прием салици лата натрия, дигиталиса и пр.);

3) технические погрешности при постановке реакций.

Различают острые и хронические ложноположительные реакции. Острые ложноположительные реакции не стойки и их спонтанная негативация происходит в течение

4–6 мес. Хронические реакции сохраняются положительными более 6 мес.

Причинами острых биологически ложноположитель ных реакций являются беременность (особенно в послед ние недели ее и первые 10 дней после родов); воспаление легких, в частности, микоплазменной этиологии; корь, энтеровирусная инфекция, инфекционный мононуклеоз, вакцинация, наркомания, алкоголизм. Реже они наблю даются при активном туберкулезе, скарлатине, вирусной пневмонии, бруцеллезе, риккетсиозах, лептоспирозе, кори, венерической лимфогранулеме, малярии, белковом голодании. У больных, прекративших принимать нарко тики, ложноположительные серологические реакции на сифилис сохраняются до 14 мес. Иногда причинами не специфических серологических реакций бывают обшир ные травмы, сотрясение головного мозга, переломы, ин фаркт миокарда, а также технические погрешности при постановке реакций.

Хронические ложноположительные стандартные серологические реакции могут наблюдаться у больных лепрой, системной красной волчанкой, тиреоидитом Хашимото, ревматизмом, узелковым периартериитом, циррозом пе чени, саркоидозом, генерализованной склеродермией, криоглобулиновой пурпурой, злокачественными опухо лями, малярией, туберкулезом, бруцеллезом, лептоспи розом, инфекционным мононуклеозом, сахарным диабе том, болезнями крови, гипертонической болезнью, хроническим алкоголизмом и наркоманией. С возрастом количество ложноположительных результатов увеличи вается. У женщин они наблюдаются в 4,5 раза чаще, чем у мужчин. Иногда причины ложноположительных реак ций остаются неясными (идиопатические реакции) или они наблюдаются спонтанно в некоторых семьях.

Неспецифические серологические реакции составляют в среднем 0,03–2,5%. Чаще они бывают слабоположи тельными, а если положительными, то с низким титром сифилитических реагинов. При некоторых заболеваниях (лимфомах, хроническом лимфолейкозе, ревматоидном артрите, раке печени) титр их, однако, может быть высо ким. При повторном исследовании неспецифические ре акции становятся отрицательными или выраженность их снижается, в то время как титр сывороток больных сифи лисом остается таким же или нарастает.

При неспецифических результатах наблюдаются расхождения РВ и осадочных реакций. Иногда отмечается несовпадение результатов реакций при постановке ее с разными антигенами: с одним антигеном получают поло жительные результаты, с другим - отрицательные. В слу чае резкого расхождения исследования надо повторить с новой порцией крови, но не раньше, чем через неделю. Наиболее достоверным критерием истинно сифилитиче ских показаний классических серологических реакций является результат, полученный при исследовании крови с помощью РИТ, хотя она иногда также дает ложнополо жительные и ложноотрицательные результаты.

В подобных случаях следует использовать серологические реакции, позволяющие обнаружить антитела класса IgM, являющиеся наиболее специфическими для сифи лиса (IgM FTA ABS, IgM FTA 19S).

Группа специфических серологических реакций

Существует пять основных типов специфических реакций, в которых используется трепонемный антиген. Они отличаются друг от друга методами определения комплексов антиген - антитело: иммунофлюоресценция, иммобилизация, иммуноферментный анализ, гемагглю цинация, фиксация комплемента.

1. Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) занимает центральное положение среди специфических реакций.

Принцип ее заключается в том, что исследуемой сыворот кой обрабатывается антиген, который представляет со бой бледная трепонема штамма Никольса, полученный из орхита кролика, высушенный на предметном стекле и за фиксированный ацетоном.

После промывания препарат обрабатывается люминесцирующей сывороткой против глобулинов человека. Флюоресцирующий комплекс (античеловеческий глобу лин + флюоресцеин тиоизоционат) связывается с челове ческим глобулином на поверхности бледной трепонемы и может быть идентифицирован методом люминесцентной микроскопии.

Для серодиагностики сифилиса используется несколько модификаций РИФ:

А) реакция иммунофлюоресценции с абсорбцией (РИФ6Абс.). Групповые антитела удаляются из исследуе мой сыворотки с помощью разрушенных ультразвуком культуральных трепонем, что резко повышает специфич ность реакции. Поскольку исследуемая сыворотка разво дится только 1:5, то модификация сохраняет высокую чувствительность. По чувствительности и специфично сти РИФ Абс. не уступает реакции Нельсона (РИТ) и на много проще последней в постановке. РИФ Абс. стано вится положительной в начале 3 й недели после заражения (до появления твердого шанкра или одновре менно с ним) и является методом ранней серодиагности ки сифилиса. Нередко сыворотка остается положитель ной и спустя несколько лет после полноценного лечения раннего сифилиса, а у больных с поздним сифилисом - на протяжении десятилетий.

Показания для постановки РИФ Абс.:

Положительная реакция Вассермана у беременных при отсутствии клинических и анамнестических данных в пользу сифилиса;

Положительная реакция Вассермана у лиц с различными соматическими и инфекционными заболеваниями;

Отрицательная реакция Вассермана у лиц с клиниче скими проявлениями сифилиса (метод ранней диагно стики сифилиса).

Переход положительной РИФ Абс. в отрицательную, в результате проведенного лечения, является аболютным критерием успешности противосифилитического лече ния.

Ложноположительные результаты РИФ Абс. отмеча ли у беременных, алкоголиков, больных с ревматоидным артритом, системной и дискоидной красной волчанкой, склеродермией, смешанной болезнью соединительной ткани, циррозом печени. Иногда реакция бывает положи тельной у здоровых людей. Кроме того, могут быть техни ческие ошибки;

Б) реакция IgM6РИФ6Абс. Выше указано, что у боль ных с ранним сифилисом в первые недели болезни по являются IgM, которые в данный период являются но сителями специфических свойств сыворотки. В более поздние сроки болезни начинают преобладать IgG. Этот же класс иммуноглобулинов ответственен и за ложнопо ложительные результаты, так как групповые антитела бывают результатом длительной по времени иммуниза ции сапрофитными трепонемами (полости рта, половых органов и др.).

Раздельное изучение классов Ig представляет особый интерес при серодиагностике врожденного сифилиса, где противотрепонемные антитела, синтезированные в орга низме ребенка, будут представлены IgM, а IgG будут ма теринского происхождения. Реакция IgM РИФ Абс. ос нована на использовании во второй фазе коньюгата анти IgM, вместо античеловеческого флюоресцирующе го глобулина.

Показания для постановки этой реакции:

Серодиагностика врожденного сифилиса, так как реак ция позволяет исключить IgG материнского происхож дения, которые проходят через плаценту и могут обу словить ложноположительный результат РИФ Абс., при отсутствии у ребенка активного сифилиса;

Дифференцировка реинфекции (повторного зараже ния) от рецидива сифилиса, при котором будет положи тельной РИФ Абс., но отрицательной IgM РИФ Абс.;

Оценка результатов лечения раннего сифилиса: при полноценном лечении IgM РИФ Абс. из положитель ной переходит в отрицательную. При постановке этой реакции в редких случаях могут наблюдаться ложнопо ложительные и ложноотрицательные результаты;

В) реакция 19SIgM6РИФ6Абс. В основе этой модифика ции РИФ лежит предварительное разделение более круп ных молекул 19SIgM от более мелких молекул 7SIgG ис следуемой сыворотки. Это разделение может быть произведено с помощью гель фильтрации. Исследование в реакции РИФ Абс. сыворотки, содержащей только фракцию 19SIgM, устраняет все возможные источники ошибок. Однако техника постановки реакции (особенно фракционирование исследуемой сыворотки) сложная и трудоемкая, что серьезно ограничивает возможность ее практического использования.

2. Реакция иммобилизации бледных трепонем (РИТ). Это первая из специфических реакций, предложенная для серодиагностики сифилиса. Принцип реакции за ключается в том, что при смешивании сыворотки больно го со взвесью живых патогенных бледных трепонем в присутствии комплемента утрачивается подвижность бледных трепонем, в то время как при смешивании взвеси бледных трепонем с сывороткой здоровых, подвижность бледных трепонем сохраняется длительное время. Выявляемые в этой реакции антитела иммобилизины относят ся к поздним антителам; они появляются позже компле ментсвязывающих антител и достигают максимального титра к десятому месяцу болезни, поэтому как метод ран ней диагностики реакция непригодна. Однако при вто ричном нелеченном сифилисе реакция бывает положи тельной в 95% случаев. При третичном сифилисе РИТ дает положительные результаты от 95 до 100% случаев. При сифилисе внутренних органов, ЦНС, врожденном сифилисе доля положительных результатов РИТ при ближается к 100%. Чувствительность и специфичность РИТ примерно такие же как в РИФ Абс., за исключением диагностики раннего сифилиса. Негативация РИТ в ре зультате полноценного лечения наступает не всегда; реак ция может оставаться положительной на протяжении многих лет. Показания к постановке реакций такие же, как для РИФ Абс. Из всех специфических реакций РИТ наиболее сложная и трудоемкая реакция, поэтому за ру бежом ее используют только при обследовании в сомни тельных случаях.

Ложноположительная РИТ может наблюдаться у больных лепрой, трепонематозными заболеваниями (пинта, беджель и пр.), злокачественными заболевания ми, красной волчанкой, сердечно сосудистыми заболева ниями, пневмонией. Следует учитывать, что РИТ может оказаться ложноположительной, если в исследуемой сы воротке содержатся трепонемоцидные вещества (напри мер, пенициллины, тетрациклины, эритромицин), вызы вающие неспецифическую иммобилизацию бледных трепонем, поэтому нельзя исследовать кровь на РИТ ра нее 2 нед после окончания приема антибиотиков и других противосифилитических препаратов.

3. Иммуноферментный анализ (ИФА). Принцип метода заключается в том, что антигенами бледной трепонемы сенсибилизируется поверхность твердофазового носителя (лунки панелей из полистирола или акрила). Затем в такие лунки вносится исследуемая сыворотка. При нали чии в сыворотке антител против бледных трепонем обра зуется комплекс антиген - антитело, связанный с поверх ностью носителя. На следующем этапе в лунки наливают антивидовую (против глобулинов человека) сыворотку, меченную ферментом (пероксидазой или щелочной фос фатазой). Меченые антитела (конъюгат) взаимодейству ют с комплексом антиген - антитело, образуя новый ком плекс. Для его выявления в лунки наливают раствор субстрата (5 аминосалициловая кислота). Под действием фермента субстрат меняет цвет, что указывает на положи тельный результат реакции. По чувствительности и спе цифичности метод близок к РИФ Абс. Показания к по становке ИФА такие же, как для РИФ Абс. Разработаны макро и микроварианты ИФА. Реакция может быть ав томатизирована.

4. Реакция непрямой гемагглютинации (РПГА). Принцип реакции заключается в том, что в качестве антигена используются формалинизированные и таннизирован ные эритроциты, на которых адсорбированы антигены бледной трепонемы. При добавлении такого антигена к сыворотке больного происходит склеивание эритроци тов - гемагглютинация. Специфичность и чувствитель ность реакции выше по сравнению с другими методами обнаружения антител к бледной трепонеме при условии высокого качества антигена. Реакция становится поло жительной на 3 й неделе после заражения и остается та ковой спустя много лет после выздоровления. Число лож ноположительных и ложноотрицательных результатов невелико. Разработан микрометод этой реакции, а также автоматизированная реакция микрогемагглютинации. Аналогом этой реакции за рубежом является ТРНА (T. pallidum haemagglutination).

5. Реакция гемабсорбции в твердой фазе (IgM6SPHA) (IgM - Solid phase haemabsorption). Это новая серологическая реакция, отвечающая, видимо, всем требованиям, предъявляемым к методам серодиагностики сифилиса. Реакция высокочувствительна и специфична, технически легко выполнима, становится положительной со 2 й не дели после заражения. И хотя пока еще недостаточно фактического материала для объективной оценки ее дос тоинств и недостатков, реакция представляется весьма перспективной. Принцип ее заключается в том, что стен ки лунок полистироловой панели покрываются анти IgM против человеческой сыворотки. Затем в лунки наливает ся исследуемая сыворотка со специальным абсорбирую щим разбавителем. На третьем этапе в лунки добавляют эритроцитарный диагностикум.

В положительных случаях происходит гемагглютинация - эритроциты фиксируются на стенках лунок, в от рицательных - эритроциты оседают на дно лунок в виде диска. Реакция может быть поставлена в качественном и количественном вариантах и доступна автоматизации.

Роль серологических реакций при оценке эффективности терапии. Серологические реакции являются показа телем эффективности лечения. Их необходимо проводить перед началом, во время и после противосифилитическо го лечения. При первичном сифилисе это особенно важно для определения длительности лечения, а при вторичном и других формах сифилиса - для оценки результатов ле чения.

Многочисленными исследованиями установлены примерные сроки негативации серологических реакций у больных с различными клиническими формами сифи лиса после окончания полноценного специфического лечения. У некоторых больных, однако, несмотря на полноценное лечение, серологические реакции остаются положительными и после него. В этих случаях речь мо жет идти о серорезистентности пролеченных больных или о стойко положительных серологических реакциях.

При этом нередко употребляемое определение «сероре зистентный сифилис» следует считать неверным, так как оно заранее предполагает, что у человека, страдаю щего сифилисом, положительные серологические реак ции. Причины серорезистентности во многом остаются не ясными. По мнению Н. М. Овчинникова и Т. В. Василь ева (1987), общей причины серорезистентности не суще ствует. Также нельзя однозначно ответить, нужно ли про должать лечение таких больных. Основными причинами серорезистентности являются:

Поздно начатое и неполноценное лечение больного;

Наличие у больных сифилисом хронических сопутствующих заболеваний (туберкулез, малярия и т. п.);

Присутствие трепонем в очагах, трудно доступных для действия антибиотиков (особенно если они находятся в измененной форме или в полимембранных фагосомах);

Переход бледных трепонем в формы, трудно поддаю щиеся действию пенициллина (L формы, цисты, грану лы), а также наличие в организме больного флоры, вы рабатывающей пенициллиназу, полностью или частично нейтрализующую пенициллин; нахождение трепонем в полимембранных фагосомах клеток орга низма, что делает трепонемы недоступными для дейст вия антибиотика и антител;

Нарушения липидного обмена.

Существует также точка зрения, что серорезистент ность у лиц, получивших полноценное специфическое ле чение и не имеющих никаких признаков сифилиса, явля ется результатом аутоиммунных реакций, происходящих в организме (аутоаллергия). Возможно, что у некоторых людей серорезистентность является анамнестической следовой реакцией уже в отсутствие бледных трепонем. Таким образом, вопрос о причинах серорезистентности и необходимости продолжения лечения должен решаться индивидуально.

Техника взятия крови для серологических реакций.

Кровь для исследования на РВ, РИФ и РИТ берут из локтевой вены натощак или не ранее чем через 4 ч после приема пищи шприцем или одной иглой (самотеком). В чистую пробирку вливают 5–7 мл крови (пробирка для исследования на РИТ должна быть специально подготов лена и стерильна).

Кровь для исследования экспресс методом берут из кончика пальца, как это делают при взятии ее на СОЭ, но берут на один капилляр больше. Можно также экс пресс метод ставить с сывороткой крови, полученной венепункцией.

При необходимости проведения исследования в некоторых лабораториях можно вместо крови пересылать су хие сыворотки. Для этого на следующий день после забо ра крови сыворотку отделяют от сгустка. Затем набирают

1 мл сыворотки в шприц и выливают ее в виде двух отдельных кружков на полоску плотной писчей бумаги, вощанки или целлофана размером 6 8 см. На свободном крае бума ги надписывают фамилию, инициалы больного и дату за бора крови. Сыворотку на бумаге, защищенную от пря мых лучей солнца и пыли, оставляют до следующего дня при комнатной температуре; она засыхает в виде неболь ших кружков блестящей желтой стекловидной пленки. После этого полоски бумаги с высушенной сывороткой завертывают так, как завертывают аптечный порошок, и отсылают в лабораторию с указанием диагноза и повода для исследования.

Исследование спинномозговой жидкости. Ликворологическая диагностика имеет чрезвычайно важное зна чение для установления диагноза нейросифилиса, а так же при определении излеченности больного сифилисом. Лабораторное исследование спинномозговой жидкости

Рекомендуется производить перед снятием с учета после соответствующего клинико лабораторного контроля. Следует иметь в виду, что в ряде случаев патологическая спинномозговая жидкость возможна при отрицательных стандартных серологических реакциях.

Нормальная спинномозговая жидкость бесцветная, прозрачная, при хранении не образует осадка, относи тельная плотность ее 1006–1007; рН 7,35–7,4; содержание белка от 10 до 25 мг%;в1 мл нормального ликвора может содержаться от 0 до 3–5–7 форменных элементов.

Для определения специфических сифилитических изменений спинномозговой жидкости рекомендуются сле дующие тесты: определение общего содержания белка, подсчет форменных элементов, глобулиновые реакции, реакция Вассермана с тремя разведениями спинномозго вой жидкости и коллоидная реакция с хлорным золотом (реакция Ланге), РИТ, РИФ 10 и РИФц (реакция имму нофлюоресценции с цельным неразведенным ликвором).

Определение общего белка. В патологически измененной спинномозговой жидкости больного сифилисом уве личивается количество белка. Определяется это в ступен чатых разведениях ликвора изотоническим раствором хлорида натрия от 1:5 до 1:80.

Количественное определение форменных элементов.

В нормальном ликворе, как правило, содержатся единич ные форменные элементы (лимфоциты). Увеличение числа форменных элементов и появление при плеоцитозе наряду с лимфоцитами плазматических клеток и моноци тов свидетельствует о патологическом изменении спин номозговой жидкости.

Глобулиновые реакции. Важное значение в диагностике патологии ликвора имеет определение в спинномозговой жидкости тяжелой фракции белков - глобулинов. К гло булиновым реакциям относятся реакции Нонне - Апель та и Панди, в основу которых положено свойство некоторых солей в определенных концентрациях осаждать избирательно глобулины из спинномозговой жидкости.

Реакция Ланге (реакция с коллоидным раствором хлорного золота). Принцип реакции основан на том, что коллоидные растворы золота, не изменяющиеся под влиянием ступенчатых разведений нормальной спинно мозговой жидкости, при тех же условиях в патологически измененной спинномозговой жидкости в присутствии электролитов (раствора хлорида натрия) претерпевают изменение степени дисперсности в зависимости от разве дения этой жидкости. Процесс выражается изменением цвета коллоидного раствора при выпадении осадка. Реак ция Ланге с коллоидным раствором хлорного золота име ет и диагностическое, и дифференциально диагностиче ское значение при раннем определении сифилитического поражения нервной системы.

Реакция Вассермана со спинномозговой жидкостью.

При сифилисе в спинномозговой жидкости могут содер жаться реагины и антитрепонемные комплементсвязываю щие антитела, которые определяются соответствующими антигенами. В спинномозговой жидкости отсутствует комплемент, поэтому реакцию Вассермана ставят с не инактивированным ликвором. Спинномозговая жид кость исследуется в реакции Вассермана неразведенной в объеме 0,5 мл и разведенной изотоническим раствором хлорида натрия 1:1 и 1:4.

Установлено, что резкоположительная и положительная реакции Вассермана со спинномозговой жидкостью являются доказальством наличия у обследуемого сифи литической инфекции, но при этом необходимо иметь в виду, что отрицательные результаты реакции Вассермана не полностью исключают сифилис. В этих случаях необ ходима постановка других реакций.

РИФ и РИТ в спинномозговой жидкости. В настоящее время считается, что эти реакции со спинномозговой жидкостью являются абсолютно специфичными для сифилиса. РИФ в этих случаях используют в модификаци ях РИФ 10 и РИФц. Методики постановки и учет ре зультатов РИФ и РИТ в ликворе проводятся так же, как и при исследовании крови.

Диагноз активного нейросифилиса. Для оценки активности нейросифилиса можно использовать эмпириче

Ские критерии, предложенные в 1949 г. Datter и Thomas:

1) нейросифилис может протекать асимптомно даже при наличии выраженной активности патологиче ского процесса в центральной нервной системе; от сутствие клинических симптомов не является пока зателем легкого течения нейросифилиса;

2) активность нейросифилиса не определяется поло жительными стандартными и серологическими ре акциями; более достоверным критерием является их сочетание с повышенным цитозом и общим ко личеством белка в спинномозговой жидкости;

3) при излечении нейросифилиса цитоз в спинномоз говой жидкости становится нормальным через 3–4 мес после окончания терапии, тогда как количест венные стандартные серологические реакции и об щий белок приходят в норму значительно позднее;

4) у больных активным нейросифилисом после лече ния пенициллином может наблюдаться тенденция к нормализации спинномозговой жидкости, что не исключает возможности рецидива болезни. Реци дивы нейросифилиса, однако, редко возникают раньше, чем через 1 год после окончания терапии. Если в спинномозговой жидкости нормализации цитоза, общего количества белка и стандартных се рологических реакций не происходит через 6 мес после окончания специфической терапии, больно му показано повторное лечение даже при отсутст вии клинических симптомов нейросифилиса.

Кроме указанных выше критериев в США для выявле ния активного нейросифилиса используют исследование реакции IgM SPHA, РИФ Абс. и РПГА. Если первая ре акция положительна, то у больного имеется активный нейросифилис. Две последние реакции позволяют ис ключить сифилитическую инфекцию центральной нерв ной системы.